用于蛋白质生产的无细胞系统：与活细胞相比的优势

用于蛋白质生产的无细胞系统：与活细胞相比的优势

无细胞蛋白质合成（CFPS）是在活细胞的复杂环境外生产蛋白质的革命性方法，在优化的反应混合物中使用提取的细胞机械。在 Cytion，虽然我们的核心专长集中在活细胞和细胞系上，但我们认识到，无细胞系统为特定应用提供了独特的优势，是对基于细胞方法的补充。这些系统将蛋白质生产从细胞活力、调控途径和膜屏障的限制中解放出来，实现了有毒蛋白质的合成、非天然氨基酸的加入、基因构建物的快速原型开发以及在资源有限的环境中的生产。要了解何时采用无细胞系统和传统细胞培养方法，需要了解每种方法的优势和局限性。

特点	活细胞系统	无细胞系统
生产速度	数小时至数天（需要生长）	分钟至小时（立即合成）
有毒蛋白质	通常不可能或需要诱导系统	无存活率限制；任何蛋白质都有可能
翻译后修饰	原生修饰（取决于宿主）	有限；可用微粒体补充
规模	高度可扩展性（从升到工业生物反应器）	可扩展性有限（通常从微升到毫升）
成本	规模化时每毫克成本较低	试剂成本较高；少量使用经济实惠
定制	受细胞代谢限制	高度可调；可直接获取反应成分

无细胞蛋白质合成原理

CFPS 系统包含蛋白质合成所需的最少细胞成分：核糖体、翻译因子、氨基酰-tRNA 合成酶、tRNA、氨基酸、能量源（ATP、GTP）和能量再生系统。这些成分通常以细菌（大肠杆菌）、真核生物（小麦胚芽、兔网状细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞）细胞裂解液的形式制备，或以纯化成分（PURE 系统）重组。当获得编码目标蛋白质的 DNA 模板或 mRNA 时，这些系统通过与活细胞相同的基本机制合成蛋白质，但没有维持细胞平衡、膜完整性或调控网络的复杂性。这种简化既是一种限制（缺少细胞功能），也是一种优势（消除了不必要的复杂性）。

无细胞系统的类型

无细胞细菌系统主要以大肠杆菌裂解物为基础，具有生产率高、成本低和广泛优化的特点。不过，它们缺乏真核翻译后修饰，可能无法正确折叠复杂的真核蛋白质。小麦胚芽提取物提供了真核翻译机制，核酸酶和蛋白酶活性较低，是生产完整蛋白质的绝佳原料。兔网状细胞裂解物富含翻译因子，擅长生产少量高活性蛋白质。哺乳动物裂解物（HeLa、CHO 或 HEK293 衍生）最接近人类细胞机制，支持真实折叠和修饰。PURE 系统由纯化的大肠杆菌成分重组而成，可完全控制成分，但需要大量专业知识来制备和优化。选择哪一种取决于目标蛋白质的要求和应用。

优势：速度和产量

与细胞表达（包括转化、菌落选择、培养生长和诱导）所需的天数相比，无细胞系统可在几分钟到几小时内合成蛋白质。这种速度可实现高通量应用：筛选数百种蛋白质变体、测试不同的表达构建物或优化密码子和调控元件。对于需要快速原型设计的研究应用而言，这种时间节省具有变革性意义。大量的蛋白质变体库可以在微孔板格式中并行生产，从而实现系统的结构-功能研究或抗体筛选活动，而使用基于细胞的方法是不切实际的。省去了克隆、转化和培养步骤，大大缩短了从基因到蛋白质的时间。

优势：有毒和难制备的蛋白质

有些蛋白质无法在活细胞中生产，因为它们会破坏细胞的基本过程。会导致细胞溶解的膜蛋白、降解细胞蛋白的蛋白酶、干扰基因表达的转录因子或引发细胞凋亡的蛋白质，都给基于细胞的生产带来了挑战。无细胞系统则完全避免了这些问题--没有细胞需要杀死。同样，容易发生聚集或错误折叠的蛋白质有时也可以在无细胞系统中通过改变条件（调整氧化还原电位、特定伴侣或改变温度）来生产，而这些条件与细胞活力是不相容的。这种能力扩大了可利用的蛋白质空间，超出了活细胞所能生产的范围。

优势：加入非天然氨基酸

无细胞系统可直接加入非天然氨基酸、荧光标记、交联剂或同位素标记，用于结构研究。通过在反应中省略天然氨基酸而代之以类似物，研究人员可以在特定位点或全局范围内替换氨基酸。这种方法可以在不使用基因编码系统的情况下对蛋白质进行标记，生产出具有新特性（增强稳定性、光交联能力、光谱处理能力）的蛋白质，或者在不使用昂贵的同位素标记生长介质的情况下制备用于核磁共振研究的同位素标记蛋白质。无细胞反应的开放性使这种修饰比在活细胞中简单得多，因为在活细胞中，膜屏障和新陈代谢的复杂性会造成障碍。

优点直接控制反应条件

无细胞反应的易操作性使得在细胞中无法实现的优化成为可能。研究人员可以直接调节 pH 值、离子强度、氧化还原电位、金属离子浓度或温度，而无需考虑细胞活力。特定的折叠催化剂、伴侣或辅助因子可以精确的浓度添加。对于二硫键蛋白，可通过添加特定比例的还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽来微调氧化还原平衡。对于金属蛋白，可添加适当的金属离子。通过对生化环境的这种控制，可以优化产量并适当折叠在标准细胞环境中失效的具有挑战性的目标。

局限性：翻译后修饰

无细胞系统的一个主要局限是翻译后修饰不完整或缺失。细菌提取物缺乏糖基化机制、磷酸化系统和许多其他真核修饰。与活细胞相比，即使是真核提取物也可能显示出较低的修饰效率。对于需要真实糖基化、磷酸化或其他修饰才能产生活性的蛋白质来说，这是一个问题。目前存在部分解决方案：与膜微粒体（ER 衍生囊泡）共同翻译可实现部分糖基化和膜插入；补充特定激酶可实现磷酸化；化学连接方法可在合成后添加修饰。不过，对于需要复杂、成熟修饰的蛋白质来说，活细胞--尤其是生产真实人类蛋白质的哺乳动物细胞--仍然具有优势。

局限性：可扩展性和成本

无细胞系统通常以较小的规模（微升到毫升）运行，生产微克到毫克的数量。虽然这足以满足许多研究应用的需要，但与活细胞培养相比就相形见绌了，因为活细胞培养的规模通常可达数百升，产量为克级。由于成分（核苷酸、氨基酸、能量再生系统）昂贵，无细胞反应的试剂成本很高，因此大规模生产在经济上是不利的。对于需要大量蛋白质的应用（治疗生产、需要大量蛋白质的结构研究或工业酶制剂），活细胞发酵仍然更具成本效益。无细胞系统擅长小规模、高多样性的应用，而非批量生产。

局限性：蛋白质的稳定性和积累

在活细胞中，蛋白质可在细胞内高浓度积累，分泌到培养基中，或形成稳定的包涵体供日后纯化。无细胞反应缺乏这种区隔，合成的蛋白质与所有细胞机械、降解酶和污染物一起留在粗反应混合物中。随着时间的推移，这可能会导致蛋白水解降解。延长合成过程需要连续流动或透析配置，以提供营养并清除废品，从而增加了复杂性。从无细胞反应中进行纯化可以很简单（使用亲和标签），但起始材料通常比细胞提取物更稀释、更复杂，可能会降低纯化后的产量。

合成生物学和代谢工程中的应用

无细胞系统是在活细胞中实施合成基因电路之前进行原型设计的绝佳平台。研究人员可以在数小时而不是数天内测试启动子、核糖体结合位点、调控元件和基因线路设计，大大加快了设计-构建-测试的周期。由于不存在细胞代谢，消除了原生调控网络的干扰效应，从而能更清楚地了解合成元件的行为。多酶代谢途径可在体外重组，从而在将这些途径工程化到活细胞之前，对酶的比例、反应条件和辅助因子循环系统进行优化。这种无细胞原型设计减少了传统代谢工程所需的反复试验。

在结构生物学中的应用

结构生物学家利用无细胞系统生产用于核磁共振光谱学或 X 射线晶体学的标记蛋白质。通过在无细胞反应中使用标记氨基酸，可轻松实现选择性或均匀同位素标记（¹⁵N、¹³C、²H），从而避免使用昂贵的同位素标记生长介质。对于众所周知难以在细胞中生产的膜蛋白，辅以去垢胶束或纳米盘的无细胞系统可以在接近原生膜的环境中生产功能性蛋白质。通过并行生产多种变体、具有不同边界的构建体或旨在增强结晶的融合蛋白，可实现高通量结晶筛选。虽然活细胞也能生产同位素标记的蛋白质，但无细胞系统的简便性和可控性为许多结构应用提供了优势。

抗体发现和工程中的应用

无细胞系统可快速生产和筛选大型抗体库，从而加速抗体工程。核糖体展示等展示技术通过阻滞核糖体将基因型和表型物理地联系起来，可以从超过 10¹² 个变体的文库中筛选出高亲和力的结合体--远远大于基于细胞的展示方法。抗体片段（scFv、Fab）可以高通量格式生产，用于活性筛选、亲和力成熟或人源化工作。无细胞系统还能在特定位点加入交联剂或标签，用于生物物理研究。虽然哺乳动物细胞对于生产全长糖基化治疗性抗体仍然至关重要，但无细胞系统在发现和优化阶段表现出色，因为在这些阶段，速度和文库规模是最重要的。

在诊断和护理点检测中的应用

无细胞系统可分散生产用于诊断的蛋白质，这在资源有限的环境中尤为重要。冷冻干燥的无细胞反应物可在室温下保存数月，然后与模板 DNA 一起重组，按需生产蛋白质传感器、抗体或酶。有了这种能力，就可以在没有冷链要求的情况下实地部署诊断工具。在 COVID-19 大流行期间，无细胞系统被用于快速生产血清学测试所需的病毒抗原或诊断分析所需的分子成分。冻干无细胞试剂的便携性和稳定性使其在缺乏传统细胞培养基础设施的全球卫生应用领域具有吸引力。

在教育和原型设计中的应用

无细胞系统的简便性和安全性使其成为极佳的教育工具，可向学生介绍分子生物学概念，而无需担心转基因生物的生物安全问题。无细胞试剂盒便于在课堂上进行蛋白质合成实验，只需数小时即可完成，而细菌表达则需要数天。对于研究原型，无细胞系统加快了设计-构建-测试周期：在投资细胞系开发、优化密码子使用、筛选融合标签或验证构建物之前，先测试基因是否能产生蛋白质。这种快速原型设计减少了在无法表达的构建物上浪费的精力，从而简化了研究工作流程。

与活细胞系统集成

精明的研究人员不会将无细胞系统和基于细胞的系统视为竞争对手，而是将它们互补使用。无细胞系统擅长初步筛选、优化和生产困难蛋白质，而活细胞则能大规模生产需要复杂修饰的良好蛋白质。典型的工作流程可能使用无细胞合成技术进行快速变体筛选，确定最佳构建体，然后将优胜者转移到细胞和细胞系中进行规模化生产。另外，无细胞系统也可能为特定检测生产有毒酶，同时在细胞中生产伴生蛋白。这种综合方法既能发挥每个系统的优势，又能减少其不足之处。

最新进展：提高产量和功能

无细胞系统性能的不断改进。连续交换无细胞（CECF）系统利用透析提供营养物质并去除抑制性副产物，从而将反应时间从数小时延长至数天，并显著提高了产量。优化能量再生系统，通常使用磷酸肌酸或磷酸烯醇丙酮酸，在整个延长的反应过程中维持 ATP 水平。补充特定的合子、折叠酶或辅助因子可改善复杂蛋白质的折叠和活性。结合不同生物体提取物的混合系统可实现优势互补--例如，使用细菌翻译机器和真核生物伴侣。这些进步缩小了无细胞系统与基于细胞系统之间的性能差距。

经济考虑因素和商业可行性

无细胞蛋白质生产的经济性在很大程度上取决于应用。对于高价值、小批量生产的产品--研究试剂、个性化疗法或诊断组件，尽管试剂成本高昂，但无细胞系统仍具有成本效益。免去培养时间、设施要求和劳动力可以抵消试剂费用。对于需要公斤级数量的商品蛋白质或治疗性抗体，发酵法仍然要经济得多。现在，商业无细胞服务公司以合同方式提供蛋白质生产服务，使这项技术无需内部专业知识即可使用。随着规模经济和工艺改进带来的试剂成本下降，无细胞系统将可用于更多应用，但很可能永远无法取代细胞进行批量生产。

未来方向与合成细胞

无细胞系统的最终发展可能是合成细胞--在脂质囊泡或液滴中含有无细胞蛋白质合成机制的人工区室，从而在没有活细胞的情况下创造出类似细胞的实体。这些合成的最小细胞可以执行有用的功能（生物传感、生物生产、药物输送），同时比活细胞更简单、更可控。最小基因组项目的进展告诉我们哪些成分是真正必要的，从而指导无细胞系统的简化。使用非天然碱基对或替代遗传密码的正交翻译系统扩大了生物学可利用的化学空间。随着这些技术的成熟，无细胞系统与活细胞之间的区别可能会变得模糊，从而形成生物与合成生产平台的连续体。

赛融的视角：互补技术

在 Cytion，虽然我们的专长集中于为研究和生物加工提供高质量的活细胞系，但我们认识到，无细胞系统在生物技术的更广阔领域发挥着互补作用。使用我们的细胞和细胞系进行蛋白质生产、功能测试或疾病建模的研究人员可能会在特定应用中受益于无细胞方法--在投入稳定细胞系开发之前进行快速筛选，生产细胞无法表达的有毒蛋白质，或加入非天然修饰。了解活体系统和无细胞系统的优势和局限性，就能为每种应用选择最合适的平台，最终加快整个生命科学领域的研究与开发。