基于细胞的化妆品测试方法：取代动物模型

基于细胞的化妆品测试方法：取代动物模型

在过去的几十年中，化妆品行业经历了一场深刻的变革，道德问题、监管要求和科学进步共同推动了产品安全评估中动物试验的淘汰。在 Cytion，我们很荣幸能支持这一转变，提供高质量的人体细胞和细胞系，作为现代体外安全性测试的基础。与传统的动物试验相比，这些基于细胞的试验不仅符合伦理要求，而且往往能提供更多与人体相关的数据，更好地预测成分和配方在人体皮肤、眼睛和粘膜上的表现。从简单的细胞毒性筛选到复杂的重构组织模型，基于细胞的方法现在涵盖了化妆品注册所需的大多数安全终点，这表明有效、人道和科学合理的动物试验替代品不仅仅是一种愿望，它们是化妆品安全科学的现在和未来。

安全终点	传统动物试验	基于细胞的替代方法	验证状态
皮肤刺激	兔皮肤斑块	重建人体表皮 (RhE) 模型	经合组织验证；监管机构认可
眼睛刺激	德雷兹兔眼试验	重建角膜、HET-CAM、BCOP	经合组织验证；分级方法
皮肤过敏	几内亚猪最大化、LLNA	直接肽反应性、KeratinoSens、h-CLAT	经合组织验证；用于定义方法
光毒性	小鼠或豚鼠紫外线照射	角质细胞 3T3 NRU 试验	经合组织验证；完全接受
皮肤腐蚀	兔皮肤应用	EpiDerm、SkinEthic 模型	经合组织验证；监管机构接受

监管环境和动物试验禁令

2013 年，欧盟禁止对化妆品成分和成品进行动物试验，并禁止销售经过动物试验的化妆品，这就迫切需要经过验证的替代品。从以色列和印度到加利福尼亚和澳大利亚，全球许多国家和地区都已实施或正在考虑实施类似禁令。这些法规驱动因素，加上消费者对无公害产品的需求，促进了对替代测试方法的大量投资。目前，《经合组织测试指南》中包含了许多经过验证的体外测试方法，监管机构认可这些方法用于安全性评估。监管机构的认可至关重要--如果监管机构不认可，即使是最科学合理的检测方法也无法符合要求。目前的情况表明，经过适当验证的细胞方法可以满足大多数安全终点的监管要求。

皮肤刺激测试：重建人体表皮

重建人体表皮 (RhE) 模型（如 EpiDerm 和 SkinEthic）由在空气-液体界面的惰性过滤支持物上培养的正常人角质细胞组成，形成组织学上类似人体表皮的分层、分化组织。这些三维组织包括功能性角质层屏障，表达适当的分化标记和脂质成分。局部涂抹在角质层上的测试物质要么会穿透角质层并造成细胞损伤，要么会被角质层屏障阻挡，从而模拟真实世界中的暴露情况。在暴露和恢复期后，使用 MTT 检测法测量细胞活力，以评估潜在的刺激性。多种 RhE 模型已通过经合组织（OECD）的验证，并在全球范围内被接受为兔子皮肤刺激测试的替代物，无需使用动物即可提供与人类相关的数据。

眼刺激测试：多层次方法

德雷兹兔眼试验长期以来一直因道德问题和人类相关性问题而饱受批评。取而代之的策略是采用结合多种体外方法的分层测试方法。重建人角膜样上皮（RhCE）模型使用分层角膜上皮细胞来评估对角膜的直接刺激。牛角膜翳和通透性（BCOP）试验使用屠宰场分离的牛眼，测量接触物质后的翳和荧光素通透性。鸡卵试验-绒毛膜（HET-CAM）利用鸡卵的血管膜来评估刺激性。使用离体细胞进行的细胞毒性检测可提供更多数据。通过将针对眼刺激性不同方面的多种方法结合起来，采用证据权重法成功预测了人眼刺激性，而无需进行家兔试验。

皮肤过敏：不良结果途径法

导致过敏性接触性皮炎的皮肤过敏涉及一个广为人知的不良结果途径：蛋白质的化学杂化、角质细胞活化和炎症信号传导、树突状细胞活化和迁移以及 T 细胞增殖。皮肤过敏检测（DAST）的定义方法不是单一的替代检测方法，而是将针对不同途径成分的多种检测方法结合在一起。直接肽反应试验（DPRA）测量与肽的化学反应性。KeratinoSens 和 LuSens 检测法使用报告细胞系来检测通过 Keap1-Nrf2ARE 通路激活的角质细胞。h-CLAT 检测法测量树突状细胞活化标记。通过确定的方法整合这些机理测定的数据，就能预测致敏可能性，从而取代豚鼠试验和局部淋巴结测定，而不会降低准确性。

角质形成细胞系的作用

人类角质细胞系，尤其是HaCaT 细胞等永生菌株，是化妆品安全性测试的主力军。这些细胞能保持角质形成细胞的特性，包括适当的分化能力、屏障蛋白表达和代谢能力，同时还能无限增殖，以进行可重复的测试。HaCaT 细胞和类似品系可用于细胞毒性试验、屏障功能研究、炎症反应试验，也可用作重建皮肤模型的基石。它们具有良好的行为特征、易于培养以及在不同实验室间的一致性，是标准化测试方案的理想选择。Cytion 提供经过认证、质量受控的角质形成细胞系，可确保研究人员和检测实验室获得可靠的起始材料，以进行有效的检测。

全厚皮肤模型中的真皮成纤维细胞

虽然表皮模型足以满足许多终点的要求，但同时包含表皮和真皮的全厚皮肤等效模型可为某些应用提供额外的生理相关性。这些模型使用嵌入胶原蛋白基质中的成纤维细胞来创建真皮区，顶部是在气液界面分层和分化的角质细胞。全厚模型能更好地再现真皮与表皮之间的相互作用、细胞外基质的组成以及物质的深层渗透。它们对于测试伤口愈合产品、评估深层渗透配方的刺激性或研究涉及真皮细胞的炎症反应尤为重要。在高级模型中加入类似血管的结构或免疫细胞可进一步提高生理相关性。

细胞毒性试验：安全性测试的基础

基本细胞毒性评估是大多数化妆品安全性测试的基础。这些检测方法将细胞暴露于不同浓度和持续时间的检测物质中，然后使用代谢活性（MTT、氨蓝）、膜完整性（LDH 释放、胰蓝排除）或 ATP 含量来测量细胞活力。中性红吸收测定可测量溶酶体的完整性。高含量成像可同时量化多个参数，包括细胞数量、形态和亚细胞损伤。虽然简单的细胞毒性数据不能预测所有的不良反应，但它能确定急性毒性浓度，并提供风险评估所必需的剂量-反应关系。使用确定的细胞系进行标准化细胞毒性试验，可提供可重复的定量数据，这些数据与许多物质的体内毒性密切相关。

遗传毒性和突变性测试

评估遗传损伤对化妆品安全至关重要。细菌艾姆斯试验虽然不是基于细胞的哺乳动物试验，但可筛选致突变性。以哺乳动物细胞为基础的遗传毒性检测包括体外微核试验和彗星试验（单细胞凝胶电泳），前者可检测培养细胞中染色体的损伤，后者可显示 DNA 链的断裂。小鼠淋巴瘤胸苷激酶试验可检测基因突变和染色体损伤。这些体外遗传毒性检测方法与计算预测相结合，在很大程度上取代了基于动物的遗传毒性检测。阳性结果需要仔细解读，并可能需要额外的测试，但使用培养细胞可以有效地进行初步筛选，而无需使用动物。

光毒性评估

某些化妆品成分只有在暴露于光线时才会产生毒性，引起光毒性反应。经过验证的 3T3 中性红吸收光毒性测试将小鼠成纤维细胞 3T3 暴露于有紫外线照射和无紫外线照射的测试物质中，通过比较存活率来确定光活性化合物。人类角质细胞也可用于光毒性筛选，从而提供更多与人类相关的数据。这些检测方法可以识别在光照射下产生活性氧或其他破坏性产物的物质，从而使配方设计师避免使用或适当配制可能具有光毒性的成分。这种检测方法简单、可重复，完全可以替代动物光毒性测试。

吸收和渗透研究

了解物质如何渗透皮肤对功效（确保活性成分到达目标）和安全性（防止有害成分的全身暴露）都至关重要。弗朗兹扩散细胞实验使用重建的皮肤模型或人体皮肤外植体来测量物质随时间在皮肤层中的渗透情况。胶带剥离与定量分析相结合，揭示了物质分布的深度剖面。荧光标记化合物共聚焦显微镜可实时观察渗透情况。与动物皮肤研究相比，这些使用人体组织模型的方法能为人体风险评估提供更多相关数据，而动物皮肤研究由于在皮肤结构、厚度和脂质成分方面存在物种差异，往往不能很好地预测人体的渗透性。

成品配方测试

单个成分测试固然重要，但化妆品是复杂的配方，其中的成分可能会相互作用，载体也会影响传递和刺激潜力。基于细胞的方法可以测试成品配方，评估消费者将使用的实际产品。这对于免洗产品（润肤霜、防晒霜）和冲洗产品（洁面乳、洗发水）尤为重要，因为两者的接触情况不同。配方测试还能揭示本应安全的成分在混合使用时是否会产生问题，或者配方载体是否能减轻潜在的刺激性。这种真实世界测试方法可确保安全评估反映消费者的实际接触情况，而不仅仅是孤立的成分危害。

敏化测试：机理测定

从以动物为基础的敏化测试到以细胞为基础的敏化测试的转变，体现了对机理的理解是如何产生更好的替代品的。定义的方法不是测量整个动物体内 T 细胞增殖的复杂终点，而是测试致敏必须发生的各个机理步骤。这种简化方法与综合建模相结合，无需完整的生物系统就能预测复杂的终点。例如，KeratinoSens 检测法使用的是含有荧光素酶报告基因的转基因角朊细胞，该基因由 ARE 元素控制，当角朊细胞通过 Keap1-Nrf2 通路感知到化学压力时，该基因就会被激活。这一单一的机理步骤与来自其他检测方法的数据相结合，有助于进行总体敏化预测。

高通量安全性筛选

基于细胞的检测可以对大型成分库或配方基质进行高通量筛选，从而加快安全产品的开发。自动液体处理、多孔板格式和基于成像的读数可同时测试数百或数千种物质。这种高通量是动物试验无法实现的，可在成分选择过程中主动进行安全性评估，而不是在配制后进行被动测试。基于高通量细胞数据训练的机器学习模型可在合成前预测虚拟化合物的安全性，从而进一步简化研发过程。这种建立在标准化细胞检测基础上的工业化安全性筛选方法，将化妆品开发从经验性的试错转变为数据驱动的设计。

解决皮肤多样性问题

传统的动物试验显然无法解决人类皮肤的多样性问题--不同种族和个体在黑色素含量、厚度、脂质成分或免疫反应性方面的差异。使用来自不同供体的角质细胞和黑色素细胞的细胞模型可以进行跨皮肤类型的测试。包含黑色素细胞的重建色素皮肤模型能更好地预测深肤色皮肤的反应。还可以用患有特殊皮肤病（特应性皮炎、牛皮癣）的人的细胞构建模型，以评估产品在敏感人群中的安全性。这种个性化的安全性测试方法不可能与标准化的动物模型一起使用，但却能确保化妆品在不同人群中的安全性。

测试天然和植物成分

天然和植物化妆品成分是大势所趋，但这并不能消除人们对其安全性的担忧--许多烈性毒素都是天然的。基于细胞的检测方法可有效测试植物提取物、精油和植物制剂的细胞毒性、致敏性和刺激性。植物成分中的混合物成分复杂，批次之间的差异也很大，因此需要采用细胞检测方法来进行可靠的检测。标准化的细胞检测可以揭示天然成分是否真的比合成替代品更安全，或者是否需要相同的安全控制。这种客观评估可防止天然谬误，同时确保真正安全的天然成分在可靠的安全性数据基础上获得市场认可。

超越安全性的功效测试

虽然安全性评估推动了许多基于细胞的化妆品测试，但功效声称也受益于基于细胞的验证。通过测量成纤维细胞中胶原蛋白的生成、弹性蛋白酶的抑制或角质形成细胞中分化标志物的表达，可以支持抗衰老功效的宣称。通过测量受刺激皮肤细胞中的细胞因子，可验证抗炎功效。抗氧化活性通过活性氧测定进行测量。在重建的表皮模型中证明了屏障功能的改善。这些机理功效展示与临床研究相结合，为产品声称提供了循证支持，使化妆品的功效不再是市场炒作，而是经过科学验证的。

质量控制应用

除开发测试外，基于细胞的检测还具有质量控制功能，可确保批次间的一致性并检测污染或降解。对生产批次进行快速细胞毒性筛选，可在产品发布前发现问题。货架期稳定性测试使用细胞检测法来检测配方是否会随着时间的推移而产生刺激性或失去功效。这种基于细胞方法的质量保证应用既能保护消费者，又能减少不合格批次造成的浪费，在提高安全性的同时还能带来经济效益。

替代方法的商业案例

除了道德和法规驱动因素外，细胞检测还具有商业优势。测试速度更快--几天就能得出结果，而不是动物实验的几周或几个月。高通量筛选降低了每个样品的成本，尽管每次试验的费用可能更高。与人体相关的数据可减少因动物数据错误预测人体反应而导致的代价高昂的后期失败。无公害和纯素认证可为市场营销带来优势，从而为有意识的消费者争取更高的价格。对替代方法的投资使公司能够应对不断发展的、支持无动物试验的全球法规。这些商业利益确保了在商业优势的驱动下，无论监管要求如何，都能继续向替代方法过渡。

挑战与持续发展

尽管取得了显著进展，但挑战依然存在。系统毒性终点（生殖毒性、重复剂量毒性）缺乏经过充分验证的体外替代方法，尽管器官芯片系统正在取得进展。方法验证既耗时又昂贵，导致改进型检测方法的引入速度减慢。与人体数据而非动物数据相关联需要大量临床数据集，而这些数据集有时是缺乏的。全球监管机构的接受程度各不相同，给国际公司带来了复杂性。持续投资于方法开发、验证研究和监管协调对于完成所有终点动物试验的过渡至关重要。

未来：先进模型与集成

新兴技术有望提供更先进的替代方法。结合血管、免疫细胞和微生物组元素的片上皮肤装置可模拟复杂的体内相互作用。诱导多能干细胞（iPSC）技术可创建代表人类多样性的基因多样化细胞群。多器官平台模拟系统分布和新陈代谢。人工智能整合了多种检测数据、计算预测和人类临床数据，以前所未有的准确性预测安全性。这些先进的方法最终将使动物试验不仅不符合伦理道德，而且在科学上被淘汰--无法与复杂的体外人体系统的人体相关性和机理洞察力相媲美。

Cytion致力于替代性测试

在Cytion，我们感到自豪的是，我们的细胞和细胞系为全球向无公害化妆品测试过渡做出了贡献。通过提供经过验证、质量可控的人类HaCaT 细胞、成纤维细胞和其他细胞类型，我们支持研究人员和公司在不进行动物试验的情况下开发安全、有效的化妆品。我们对质量的承诺可确保标准化测试协议中使用的细胞具有一致、可靠的性能，并产生监管机构认可的数据。随着该领域不断朝着完全取代动物试验的方向发展，Cytion 将继续提供基础生物材料，使与人类相关的、符合伦理道德的化妆品安全评估成为可能。