Adipose-Derived Stem Cells in Wound Healing Research

Riebalų kilmės kamieninės ląstelės žaizdų gijimo tyrimuose

Iš riebalinės ląstelienos kilusios kamieninės ląstelės (ADSC) dėl savo prieinamumo, gausumo ir stiprių regeneracinių savybių tapo perspektyviais žaizdų gydymo agentais. ADSC, gautos iš lipoaspirato arba išpjauto riebalinio audinio, gali būti surenkamos dideliais kiekiais taikant minimaliai invazines procedūras. Jų gebėjimas skatinti angiogenezę, moduliuoti uždegimą ir diferencijuotis į atitinkamus ląstelių tipus lemia, kad ADSC yra patrauklūs kandidatai gydyti lėtines žaizdas, nudegimus ir kitus audinių sužalojimus, kai įprasti metodai yra netinkami.

Pagrindinės išvados

• ADSC galima išskirti dideliais kiekiais iš lipoaspirato fermentinio skaidymo arba mechaninio apdorojimo būdu
• Šios ląstelės skatina žaizdų gijimą per parakrininius mechanizmus, įskaitant augimo veiksnių ir citokinų sekreciją
• ADSC tarpininkaujama angiogenezė pagreitina granuliuojančio audinio formavimąsi ir žaizdos uždarymą
• ADSC imunomoduliacinės savybės mažina uždegimą ir skatina audinių remodeliaciją
• Klinikiniais tyrimais įrodytas ADSC saugumas ir preliminarus veiksmingumas gydant lėtines žaizdas

ADSC išskyrimas ir apdorojimas

Riebalinis audinys yra gausiausias ir prieinamiausias suaugusių kamieninių ląstelių šaltinis žmogaus organizme. Liposukcijos procedūrų metu gaunamas lipoaspiratas su stromos kraujagyslių frakcijos (SVF) ląstelėmis, iš kurių ADSC išskiriami fermentinio skaidymo arba mechaninio apdorojimo būdu. Vienos liposukcijos procedūros metu galima gauti milijonus SVF ląstelių, gerokai viršijančių kiekius, gaunamus aspiravus kaulų čiulpus.

Atskiriant fermentiniu būdu, riebalinis audinys skaidomas kolagenazės tirpalu, o po to centrifuguojamas, siekiant atskirti SVF nuo subrendusių adipocitų. SVF granulėse yra ADSC, endotelio ląstelių, pericitų ir imuninių ląstelių. Vėliau, auginant plastiko adhezijos kultūroje, atrenkamos ADSC ir pašalinamos neadhezinės populiacijos. Šio proceso metu gaunami santykinai gryni ADSC preparatai, tinkami moksliniams tyrimams ir klinikiniam taikymui.

Žmogaus mezenchiminės kamieninės ląstelės - riebalinis audinys - tai charakterizuoti, kriokonservuoti preparatai, paruošti žaizdų gijimo tyrimams. Lyginamiesiems tyrimams žmogaus mezenchiminės kamieninės ląstelės - kaulų čiulpai (HMSC-BM ) yra tradicinis MSC auksinis standartas. Žmogaus mezenchiminės kamieninės ląstelės - Whartono želė (HMSC-WJ) yra alternatyva, pasižyminti didesniu proliferacijos pajėgumu.

Parakrininiai žaizdų gijimo mechanizmai

ADSC gydomasis poveikis visų pirma atsiranda dėl parakrininės bioaktyvių veiksnių sekrecijos, o ne dėl tiesioginės ląstelių diferenciacijos. ADSC sekrete yra augimo veiksnių, citokinų, chemokinų ir ekstraląstelinių vezikulių, kurie bendrai skatina žaizdų gijimą. ADSC kultūrų kondicionuota terpė rodo žaizdų gijimo aktyvumą nepriklausomai nuo ląstelių buvimo, o tai patvirtina parakrininio mechanizmo svarbą.

ADSC išskiriamas kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF) skatina žaizdų gijimui būtiną neovaskuliarizaciją. Angiogeniniai veiksniai, įskaitant pagrindinį fibroblastų augimo faktorių (bFGF), hepatocitų augimo faktorių (HGF) ir trombocitų kilmės augimo faktorių (PDGF), dar labiau skatina kraujagyslių formavimąsi. Geresnė vaskuliarizacija pagerina deguonies ir maistinių medžiagų patekimą į žaizdos vietas ir pagreitina audinių regeneraciją.

Transformuojantis augimo veiksnys beta (TGF-β) ir epidermio augimo veiksnys (EGF) skatina fibroblastų proliferaciją ir ekstraląstelinio matrikso nusėdimą. Keratinocitų augimo veiksnys (KGF) skatina epitelio ląstelių migraciją ir proliferaciją, spartindamas žaizdos pakartotinį epitelizaciją. Šis išsamus augimo veiksnių sekrecijos profilis paaiškina ADSC veiksmingumą įvairiuose žaizdų gijimo etapuose.

Imunomoduliacinės savybės

ADSC moduliuoja uždegimines reakcijas sąveikaudami su imuninėmis ląstelėmis, infiltruojančiomis į žaizdos vietas. Prostaglandino E2 (PGE2) sekrecija slopina T ląstelių proliferaciją ir skatina reguliacinių T ląstelių vystymąsi. Indoleamino 2,3-dioksigenazės (IDO) ekspresija sumažina triptofano, reikalingo T ląstelių aktyvacijai, kiekį. Šie mechanizmai kartu slopina pernelyg didelį uždegimą, kuris blogina žaizdų gijimą.

Makrofagų poliarizacija yra labai svarbus ADSC imunomoduliacinis mechanizmas. ADSC skatina perėjimą iš prouždegiminio M1 į proregeneracinį M2 makrofagų fenotipą per IL-10 ir TGF-β sekreciją. M2 makrofagai išskiria priešuždegiminius citokinus ir augimo veiksnius, palaikančius audinių atstatymą. Šis poliarizacijos pokytis pagreitina perėjimą iš uždegiminės į proliferacinę žaizdų gijimo fazę.

Ko-kultūrų tyrimai rodo ADSC poveikį imuninių ląstelių funkcijai. THP-1 ląstelės, diferencijuotos į makrofagus, yra ADSC ir makrofagų sąveikos tyrimo modeliai. Šios bendrakultūrinės sistemos atskleidžia dvikrypčius signalus, kai makrofagų išskiriami veiksniai daro įtaką ADSC sekreto sudėčiai, sukurdami grįžtamojo ryšio kilpas, stiprinančias regeneracines reakcijas.

Angiogenezės skatinimas

Lėtinių žaizdų gijimo nepakankamumas dažnai rodo nepakankamą žaizdos guolio vaskuliarizaciją. ADSC skatina angiogenezę tiesiogiai stimuliuodami endotelio ląsteles ir naudodami parakrininius mechanizmus. VEGF, angiopoetinas-1 ir kiti ADSC išskiriami angiogeniniai veiksniai aktyvina endotelio ląstelių proliferaciją, migraciją ir vamzdelių formavimąsi. Ši neovaskuliarizacija pagerina perfuziją ir palaiko granuliuojančio audinio vystymąsi.

Hipoksinė žaizdos aplinka sustiprina ADSC angiogeninių veiksnių gamybą dėl HIF-1α stabilizavimo. Šis deguonies jutimo mechanizmas reguliuoja VEGF raišką hipoksiškomis sąlygomis, kai angiogenezė labiausiai reikalinga. ADSC išankstinis kondicionavimas hipoksiškomis kultūros sąlygomis prieš žaizdos panaudojimą gali padidinti jų angiogeninį potencialą.

ADSC įdarbintos endotelio progenitorių ląstelės prisideda prie vaskuliogenezės žaizdų vietose. SDF-1 (CXCL12) sekrecija pritraukia cirkuliuojančius progenitorius, ekspresuojančius CXCR4. Šios pritrauktos ląstelės įsijungia į besiformuojančias kraujagysles ir prisideda prie ilgalaikės neovaskuliarizacijos ne tik dėl tiesioginio ADSC parakrininio poveikio.

Diferencijavimo įnašai

Nors vyrauja parakrininiai mechanizmai, ADSC diferenciacija į su žaizda susijusius ląstelių tipus suteikia papildomą regeneracinį indėlį. Fibroblastų diferenciacijos metu susidaro ląstelės, gaminančios ekstraląstelinio matrikso komponentus, būtinus granuliaciniam audiniui. Keratinocitų transdiferenciacija, nors ir prieštaringai vertinama, tinkamomis sąlygomis gali prisidėti prie žaizdos pakartotinės epitelizacijos.

ADSC endotelio diferenciacija prisideda prie kraujagyslių vystymosi žaizdų vietose. Nustatytos endotelio diferenciaciją skatinančios kultūros sąlygos, o iš ADSC gautos endotelio ląstelės pasižymi funkcinėmis savybėmis, įskaitant vamzdelių formavimąsi ir atitinkamų žymenų raišką. Santykinis diferencijuotų ADSC indėlis, palyginti su įdarbintais endogeniniais pradininkais, vis dar tiriamas.

Adipogeninė diferenciacija, numatytasis ADSC linijinis įsipareigojimas, padeda atkurti odos riebalinį audinį gilių žaizdų atveju. Odos riebalinis audinys atlieka svarbų vaidmenį odos homeostazėje ir žaizdų gijime per adipokinų sekreciją ir sąveiką su kitomis odos ląstelėmis. ADSC tarpininkaujama riebalinio audinio regeneracija atkuria šį funkcinį audinių sluoksnį.

Pristatymo metodai ir karkasai

Tiesioginis ADSC suspensijos švirkštimas į žaizdos kraštus yra paprastas, tačiau dėl to ląstelės gali prastai išsilaikyti ir išgyventi. Pakartotinio švirkštimo protokolai pagerina rezultatus, nes ląstelės išlieka per visą gijimo laikotarpį. Vietinė injekcija ypač tinka mažoms arba lengvai prieinamoms žaizdoms, kai galima atlikti pakartotinį gydymą.

Ląstelių tiekimas naudojant pastolius pagerina ląstelių išlaikymą, išgyvenamumą ir erdvinį pasiskirstymą žaizdos guolyje. Kolageno matricos, hialurono rūgšties hidrogelai ir sintetinių polimerų pastoliai sukuria trimatę aplinką, palankią ADSC veiklai. Parenkant pastolius atsižvelgiama į mechanines savybes, atitinkančias žaizdos vietą, skilimo kinetiką ir suderinamumą su ADSC išlikimu ir sekrecija.

Aceliariniai metodai, kuriuose naudojama ADSC kondicionuojama terpė arba ekstraląstelinės pūslelės, padeda išvengti ląstelių pristatymo ir saugojimo problemų. Koncentruota sąlyginė terpė, kurioje yra ADSC sekreto faktorių, rodo žaizdų gijimo veiksmingumą ikiklinikiniuose modeliuose. Egzosomų preparatai išsaugo ADSC parakrininį poveikį stabiliais, saugomais formatais, tinkamais klinikiniam taikymui.

Klinikinių tyrimų duomenys

I ir II fazės klinikiniais tyrimais nustatyta, kad ADSC saugu naudoti žaizdų gijimui. Autologinių ir alogeninių ADSC preparatų saugumas yra palankus ir nesukelia reikšmingų nepageidaujamų reiškinių gydant lėtines žaizdas. Alogeninių ADSC imunogeniškumo problemos kliniškai nepasireiškė, o tai atitinka jų imunomoduliacines savybes.

Diabetinės pėdos opos tyrimai rodo daug žadančius ADSC veiksmingumo rezultatus. Pranešama apie greitesnį žaizdų uždarymą, trumpesnį gijimo laiką ir mažesnį amputacijų skaičių gydomiems pacientams, palyginti su standartine priežiūra. Šie rezultatai atitinka svarbiausius nepatenkintus diabetinių žaizdų gydymo poreikius, kai įprastiniai metodai dažnai nepasiteisina.

Gydant nudegimo žaizdas ADSC, pagerėjo pakartotinė epitelizacija ir sumažėjo randų. Padidėjusi angiogenezė gydomuose nudegimuose palaiko transplantato išgyvenamumą ir žaizdų gijimą. Dėl ADSC poveikio randų brendimui ir remodeliacijai gaunami kosmetiniai rezultatai.

Kultūros ir kokybės aspektai

Standartizuotai ADSC kultūrai naudojama DMEM arba DMEM/F12 bazinė terpė su 10 % galvijų vaisiaus serumo. Augimo faktorių papildymas bFGF (5-10 ng/ml) padidina proliferaciją, kad būtų galima išplėsti klinikinį mastą. CM-1 užšaldymo terpė leidžia kriokonservuoti ADSC bankus, o alternatyvios terpės be serumo palaiko klinikinio lygio gamybą.

Ląstelių linijų autentiškumo nustatymas ir donorų sekimas užtikrina atsekamumą gamybos ir klinikinio naudojimo metu. Mikoplazmos testavimas apsaugo nuo užteršimo, kuris galėtų pakenkti žaizdų gijimo rezultatams. Funkciniai tyrimai, kuriais patvirtinamas diferenciacijos gebėjimas ir sekreto sudėtis, užtikrina ne tik paviršiaus žymenų apibūdinimą, bet ir kokybės rodiklius.

Išvada

Riebalų kilmės kamieninės ląstelės yra labai perspektyvios žaizdų gijimui, nes kartu veikia parakrininiai, imunomoduliaciniai ir diferenciacijos mechanizmai. Klinikiniai duomenys patvirtina saugumą ir preliminarų veiksmingumą gydant lėtines žaizdas, nudegimus ir chirurgines žaizdas. Tolesnis pristatymo metodų, dozavimo režimų ir kokybės standartų optimizavimas leis pasiekti, kad ADSC terapija taptų standartine klinikine praktika žaizdų gijimo atvejais.