Adipose-Derived Stem Cells in Wound Healing Research

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej w badaniach nad gojeniem ran

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) pojawiły się jako obiecujące środki terapeutyczne do zastosowań w gojeniu ran ze względu na ich dostępność, obfitość i silne właściwości regeneracyjne. Pozyskiwane z lipoaspiratu lub wyciętej tkanki tłuszczowej, ADSC mogą być pobierane w dużych ilościach za pomocą minimalnie inwazyjnych procedur. Ich zdolność do promowania angiogenezy, modulowania stanu zapalnego i różnicowania się w odpowiednie typy komórek pozycjonuje ADSC jako atrakcyjnych kandydatów do leczenia przewlekłych ran, oparzeń i innych urazów tkanek, w których konwencjonalne metody okazują się niewystarczające.

Kluczowe wnioski

• ADSC mogą być izolowane w dużych ilościach z lipoaspiratu poprzez enzymatyczne trawienie lub obróbkę mechaniczną
• Komórki te promują gojenie się ran poprzez mechanizmy parakrynne, w tym wydzielanie czynników wzrostu i cytokin
• Angiogeneza, w której pośredniczą ADSC, przyspiesza tworzenie tkanki ziarninowej i zamykanie rany
• Właściwości immunomodulacyjne ADSC zmniejszają stan zapalny i promują przebudowę tkanek
• Badania kliniczne wykazują bezpieczeństwo i wstępną skuteczność ADSC w leczeniu ran przewlekłych

Izolacja i przetwarzanie ADSCs

Tkanka tłuszczowa stanowi najobfitsze i najbardziej dostępne źródło dorosłych komórek macierzystych w organizmie człowieka. Zabiegi liposukcji pozwalają uzyskać lipoaspirat zawierający komórki stromalnej frakcji naczyniowej (SVF), z których izoluje się ADSC poprzez trawienie enzymatyczne lub obróbkę mechaniczną. Pojedyncza procedura liposukcji może przynieść miliony komórek SVF, znacznie przekraczając ilości uzyskiwane z aspiracji szpiku kostnego.

Izolacja enzymatyczna polega na trawieniu tkanki tłuszczowej kolagenazą, a następnie odwirowaniu w celu oddzielenia SVF od dojrzałych adipocytów. Pelet SVF zawiera ADSC wraz z komórkami śródbłonka, perycytami i komórkami odpornościowymi. Późniejsza hodowla adherentna w plastiku selekcjonuje ADSC, eliminując jednocześnie populacje nieprzylegające. Proces ten daje stosunkowo czyste preparaty ADSC odpowiednie do badań i zastosowań klinicznych.

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste - tkanka tłuszczowa są dostępne jako scharakteryzowane, kriokonserwowane preparaty gotowe do badań nad gojeniem się ran. W przypadku badań porównawczych, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste - szpik kostny (HMSC-BM) stanowią tradycyjny złoty standard MSC. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste - galaretka Whartona (HMSC-WJ) stanowią alternatywę o zwiększonej zdolności proliferacji.

Mechanizmy parakrynne w gojeniu ran

Efekty terapeutyczne ADSC wynikają przede wszystkim z parakrynnego wydzielania czynników bioaktywnych, a nie z bezpośredniego różnicowania komórek. Sekretom ADSC zawiera czynniki wzrostu, cytokiny, chemokiny i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, które wspólnie promują gojenie się ran. Kondycjonowana pożywka z hodowli ADSC wykazuje aktywność gojenia ran niezależnie od obecności komórek, potwierdzając znaczenie mechanizmu parakrynnego.

Wydzielanie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) przez ADSC napędza neowaskularyzację niezbędną do gojenia się ran. Czynniki angiogenne, w tym podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) dodatkowo promują tworzenie naczyń krwionośnych. Zwiększone unaczynienie poprawia dostarczanie tlenu i składników odżywczych do miejsc zranienia, przyspieszając regenerację tkanek.

Transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) promują proliferację fibroblastów i odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej. Czynnik wzrostu keratynocytów (KGF) stymuluje migrację i proliferację komórek nabłonkowych, przyspieszając ponowną epitelializację rany. Ten kompleksowy profil wydzielania czynników wzrostu wyjaśnia skuteczność ADSC w wielu fazach gojenia ran.

Właściwości immunomodulujące

ADSC modulują reakcje zapalne poprzez interakcję z komórkami odpornościowymi infiltrującymi miejsca zranienia. Wydzielanie prostaglandyny E2 (PGE2) hamuje proliferację limfocytów T i promuje rozwój limfocytów T regulatorowych. Ekspresja 2,3-dioksygenazy indoloaminowej (IDO) wyczerpuje tryptofan wymagany do aktywacji komórek T. Mechanizmy te wspólnie tłumią nadmierny stan zapalny, który upośledza gojenie się ran.

Polaryzacja makrofagów stanowi krytyczny mechanizm immunomodulacyjny ADSC. ADSC promują przejście z prozapalnych fenotypów M1 do proregeneracyjnych fenotypów makrofagów M2 poprzez wydzielanie IL-10 i TGF-β. Makrofagi M2 wydzielają cytokiny przeciwzapalne i czynniki wzrostu wspomagające naprawę tkanek. Ta zmiana polaryzacji przyspiesza przejście od fazy zapalnej do proliferacyjnej gojenia się rany.

Badania ko-kulturowe wykazują wpływ ADSC na funkcje komórek odpornościowych. Komórki THP-1 zróżnicowane do makrofagów zapewniają modele do badania interakcji ADSC-makrofagi. Te systemy współhodowli ujawniają dwukierunkową sygnalizację, w której czynniki pochodzące z makrofagów wpływają na skład sekretomu ADSC, tworząc pętle sprzężenia zwrotnego wzmacniające odpowiedzi regeneracyjne.

Promocja angiogenezy

Przewlekła niewydolność gojenia się ran często odzwierciedla niewystarczające unaczynienie łożysk rany. ADSC promują angiogenezę poprzez bezpośrednią stymulację komórek śródbłonka i mechanizmy parakrynne. VEGF, angiopoetyna-1 i inne czynniki angiogenne wydzielane przez ADSC aktywują proliferację komórek śródbłonka, migrację i tworzenie rurek. Ta neowaskularyzacja poprawia perfuzję i wspomaga rozwój tkanki ziarninowej.

Niedotlenione środowisko rany zwiększa produkcję czynników angiogennych ADSC poprzez stabilizację HIF-1α. Ten mechanizm wykrywania tlenu zwiększa ekspresję VEGF w warunkach niedotlenienia, gdzie angiogeneza jest najbardziej potrzebna. Wstępne kondycjonowanie ADSC w warunkach niedotlenienia przed nałożeniem na ranę może zwiększyć ich potencjał angiogenny.

Rekrutacja komórek progenitorowych śródbłonka przez ADSC przyczynia się do waskulogenezy w miejscach ran. Wydzielanie SDF-1 (CXCL12) przyciąga krążące progenitory wyrażające CXCR4. Te zrekrutowane komórki włączają się do tworzących się naczyń i przyczyniają się do trwałej neowaskularyzacji poza natychmiastowymi efektami parakrynnymi ADSC.

Wkład w różnicowanie

Podczas gdy dominują mechanizmy parakrynne, różnicowanie ADSC w typy komórek związane z raną zapewnia dodatkowy wkład regeneracyjny. Różnicowanie fibroblastów generuje komórki wytwarzające składniki macierzy zewnątrzkomórkowej niezbędne dla ziarniny. Transdyferencjacja keratynocytów, choć kontrowersyjna, może przyczynić się do reepitelializacji rany w odpowiednich warunkach.

Różnicowanie śródbłonkowe ADSC przyczynia się do rozwoju naczyń krwionośnych w obrębie ran. Ustalono warunki hodowli promujące różnicowanie śródbłonka, a komórki śródbłonka pochodzące z ADSC wykazują cechy funkcjonalne, w tym tworzenie rurek i odpowiednią ekspresję markerów. Względny udział zróżnicowanych ADSC w porównaniu z rekrutowanymi endogennymi progenitorami pozostaje przedmiotem badań.

Różnicowanie adipogeniczne, domyślne zaangażowanie linii ADSC, przyczynia się do odbudowy tkanki tłuszczowej skóry w głębokich ranach. Tkanka tłuszczowa skóry odgrywa ważną rolę w homeostazie skóry i gojeniu się ran poprzez wydzielanie adipokin i interakcje z innymi komórkami skóry. Regeneracja tkanki tłuszczowej za pośrednictwem ADSC przywraca tę funkcjonalną warstwę tkanki.

Metody podawania i rusztowania

Bezpośrednie wstrzyknięcie zawiesiny ADSC w brzegi rany zapewnia prostą dostawę, ale może skutkować słabą retencją i przeżywalnością komórek. Protokoły powtarzanych iniekcji poprawiają wyniki poprzez utrzymanie obecności komórek przez cały okres gojenia. Miejscowe wstrzykiwanie jest szczególnie odpowiednie w przypadku małych lub dostępnych ran, w których możliwe jest powtarzanie leczenia.

Dostarczanie oparte na rusztowaniach poprawia retencję, przeżywalność i rozkład przestrzenny komórek w łożysku rany. Matryce kolagenowe, hydrożele kwasu hialuronowego i rusztowania z polimerów syntetycznych zapewniają trójwymiarowe środowisko wspierające funkcjonowanie ADSC. Wybór rusztowania uwzględnia właściwości mechaniczne dopasowane do lokalizacji rany, kinetykę degradacji i kompatybilność z przeżyciem i wydzielaniem ADSC.

Podejścia bezkomórkowe wykorzystujące pożywkę kondycjonowaną ADSC lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pozwalają uniknąć wyzwań związanych z dostarczaniem i przechowywaniem komórek. Skoncentrowana pożywka kondycjonowana zawierająca czynniki sekrecyjne ADSC wykazuje skuteczność gojenia ran w modelach przedklinicznych. Preparaty egzosomowe zachowują efekty parakrynne ADSC w stabilnych, nadających się do przechowywania formatach odpowiednich do zastosowań klinicznych.

Dowody z badań klinicznych

Badania kliniczne fazy I/II wykazały bezpieczeństwo stosowania ADSC w leczeniu ran. Autologiczne i allogeniczne preparaty ADSC wykazują korzystne profile bezpieczeństwa bez znaczących zdarzeń niepożądanych w leczeniu ran przewlekłych. Obawy dotyczące immunogenności allogenicznych ADSC nie zmaterializowały się klinicznie, co jest zgodne z ich właściwościami immunomodulacyjnymi.

Badania dotyczące owrzodzeń stopy cukrzycowej wykazują obiecujące wyniki skuteczności ADSC. U leczonych pacjentów odnotowano przyspieszone zamknięcie rany, skrócenie czasu gojenia i zmniejszenie częstości amputacji w porównaniu ze standardową opieką. Wyniki te zaspokajają krytyczne niezaspokojone potrzeby w leczeniu ran cukrzycowych, gdzie konwencjonalne metody często zawodzą.

Leczenie ran oparzeniowych za pomocą ADSCs wykazuje lepszą reepitelializację i zmniejszone bliznowacenie. Zwiększona angiogeneza w leczonych oparzeniach wspomaga przeżycie przeszczepu i gojenie się ran. Efekty kosmetyczne są korzystne dzięki wpływowi ADSC na dojrzewanie i przebudowę blizn.

Hodowla i względy jakościowe

Standaryzowana hodowla ADSC wykorzystuje DMEM lub DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą. Suplementacja czynnikiem wzrostu bFGF (5-10 ng/ml) zwiększa proliferację w celu ekspansji na skalę kliniczną. Freeze Medium CM-1 umożliwia kriokonserwację banków ADSC, podczas gdy alternatywy bez surowicy wspierają produkcję na poziomie klinicznym.

Uwierzytelnianie linii komórkowych i śledzenie dawców zapewniają identyfikowalność podczas produkcji i stosowania klinicznego. Testy na obecność mykoplazmy zapobiegają zanieczyszczeniu, które mogłoby negatywnie wpłynąć na wyniki gojenia się ran. Testy funkcjonalne potwierdzające zdolność różnicowania i skład sekretomu zapewniają wskaźniki jakości wykraczające poza charakterystykę markerów powierzchniowych.

Wnioski

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej wykazują obiecujące zastosowanie w gojeniu ran dzięki połączonym mechanizmom parakrynnym, immunomodulacyjnym i różnicującym. Dowody kliniczne potwierdzają bezpieczeństwo i wstępną skuteczność w leczeniu ran przewlekłych, oparzeń i ran chirurgicznych. Ciągła optymalizacja metod dostarczania, schematów dawkowania i standardów jakości pozwoli na rozwój terapii ADSC w kierunku standardowej praktyki klinicznej w leczeniu ran.