NCI-H69 Small Cell Lung Cancer Model: Applications and Protocols

NCI-H69 smulkiųjų ląstelių plaučių vėžio modelis: Naudojimo būdai ir protokolai

Smulkialąstelinis plaučių vėžys (SCLC) yra agresyvus neuroendokrininis piktybinis navikas, kuriam būdinga greita proliferacija, ankstyvas metastazių plitimas ir pradinis atsakas į chemoterapiją, po kurio neišvengiamai įvyksta atkrytis. NCI-H69 ląstelių linija, sukurta iš SCLC sergančio paciento, yra gerai apibūdintas modelis, pasižymintis klasikinėmis SCLC savybėmis, įskaitant neuroendokrininių žymenų raišką, sustabarėjusio augimo morfologiją ir būdingus jautrumo chemoterapijai modelius. Ši ląstelių linija daug prisidėjo prie SCLC tyrimų ir išlieka kertiniu modeliu tiriant ligos biologiją ir gydymo strategijas.

Pagrindinės išvados

• NCI-H69 ląstelėms būdingi klasikiniai SCLC požymiai, įskaitant neuroendokrininę diferenciaciją ir RB1/TP53 inaktyvaciją
• Šiai ląstelių linijai būdingas pradinis jautrumas platinai ir etopozidui, o po ilgesnio poveikio išsivysto atsparumas
• Augimas suspensijos kultūroje būdingais klasteriais atspindi SCLC naviko architektūrą
• NCI-H69 leidžia ištirti neuroendokrininės diferenciacijos kelius ir galimus terapinius taikinius
• Ksenograftų modeliai, kuriuose naudojamas NCI-H69, atkartoja greitą SCLC augimo kinetiką

NCI-H69 molekulinis apibūdinimas

NCI-H69 buvo gautas iš paciento, sergančio plataus masto smulkialąsteliniu plaučių vėžiu, limfmazgių metastazių. Šiai ląstelių linijai būdingi SCLC būdingi molekuliniai požymiai, įskaitant RB1 ir TP53 naviko slopintojų inaktyvaciją, kuri yra beveik visuotinė SCLC navikų ypatybė. Šis genetinis fonas lemia šiai piktybinei ligai būdingą greitą proliferaciją ir genomo nestabilumą.

Neuroendokrininė diferenciacija yra skiriamasis SCLC biologijos bruožas, kuris atkartojamas NCI-H69 ląstelėse. Ši ląstelių linija išreiškia klasikinius neuroendokrininius žymenis, įskaitant chromograniną A, sinaptofiziną ir nervinių ląstelių adhezijos molekulę (NCAM/CD56). Transkripcijos veiksnių profiliavimas atskleidžia ASCL1 (achaete-scute homologas 1) raišką, todėl NCI-H69 priskiriama SCLC-A molekuliniam potipiui, kuriam būdinga aukšta neuroendokrininė diferenciacija.

NCI-H69 ląstelės gali būti naudojamos SCLC tyrimams. Papildomi SCLC modeliai yra NCI-H82 ląstelės, atstovaujančios SCLC potipio variantui, pasižyminčiam mažesne neuroendokrininių žymenų raiška. NCI-H146 ląstelės ir NCI-H209 ląstelės yra papildomi klasikinio SCLC modeliai, o NCI-H446 ląstelėse yra MYC amplifikacija, turinti įtakos terapiniam jautrumui.

Suspensinių kultūrų protokolai

NCI-H69 auga kaip plūduriuojantys ląstelių telkiniai, o ne sulipę monosluoksniai, atspindintys SCLC navikams būdingą morfologiją. Tokiam suspensijos augimui reikalingi modifikuoti auginimo protokolai, palyginti su adherentinėmis plaučių vėžio ląstelių linijomis. Supratus optimalias auginimo sąlygas, užtikrinamas nuoseklus ląstelių elgesys atliekant eksperimentus.

Standartiniam NCI-H69 auginimui naudojama RPMI 1640 terpė, papildyta 10 % galvijų vaisiaus serumo, 1 % penicilino ir streptomicino bei 2 mM L-glutamino. Normalaus augimo metu ląstelės formuoja trimačius 50-200 μm skersmens klasterius. Per didelis klasterių dydis rodo neoptimalias auginimo sąlygas arba ilgesnį auginimą be perėjimo. Reguliarus 2-3 dienų intervalas palaiko optimalią klasterių morfologiją ir augimo kinetiką.

RPMI 1640 terpė yra standartinė bazinė terpė NCI-H69 kultūroms auginti. Kai kurie tyrėjai ją papildo HEPES buferine terpe, kad pagerintų pH stabilumą atliekant manipuliacijas. Ham's F12 terpės deriniai gali pagerinti sublonų, kurių mitybos reikalavimai pakitę, augimą. CM-1 užšaldymo terpė leidžia kriokonservuoti apibūdintas atsargas, išlaikant nuoseklią išėjimo istoriją.

Jautrumo chemoterapijai profiliavimas

NCI-H69 demonstruoja būdingą SCLC atsako į chemoterapiją modelį - pradinį jautrumą chemoterapijai, po kurio įgyjamas atsparumas. Platinos ir etopozido deriniai - standartiniai pirmos eilės SCLC gydymo metodai - pasižymi stipriu citotoksiškumu gydymui nepasirengusiose NCI-H69 ląstelėse, o IC50 vertės yra kliniškai pasiekiamos. Dėl tokio jautrumo NCI-H69 tinka naujoms medžiagoms vertinti kaip standartinės chemoterapijos alternatyvai ar papildymui.

Įgytas atsparumas platinos junginiams gali atsirasti dėl ilgalaikio vaisto poveikio arba išlikusių subpopuliacijų atrankos. NCI-H69/R variantas yra cisplatinai atsparios NCI-H69 ląstelės, kurios leidžia atlikti atsparumo išsivystymo mechanistinius tyrimus. Lyginant tėvines ir atsparias ląsteles, nustatomi genai ir keliai, tarpininkaujantys atsparumui chemoterapijai.

Topoizomerazės taikiniai, įskaitant etopozidą ir topotekaną, yra veiksmingi NCI-H69 ląstelėms. Irinotekanas ir jo aktyvusis metabolitas SN-38 pasižymi aktyvumu platinai atspariose sublinijose, o tai atitinka klinikinį irinotekano naudojimą recidyvinio SCLC gydymui. Kombinacijų tyrimai, kuriuose vertinami nauji topoizomerazės inhibitoriai ir DNR pažeidžiantys preparatai, suteikia informacijos apie klinikinių schemų kūrimą.

Tikslinės terapijos vertinimas

Taikinių terapijos sėkmė sergant SCLC yra ribota, nes nėra vaistais valdomų onkogeninių varomųjų mutacijų, panašių į EGFR ar ALK mutacijas NSLPV. Tačiau NCI-H69 leidžia įvertinti tikslinių metodų, naudojančių specifinius SCLC pažeidžiamumus, taikymą. DLL3 (į deltą panašus ligandas 3) raiška NCI-H69 ląstelėse padeda kurti antikūnų ir vaistų konjugatus bei bispecifinius T ląstelių jungiklius, nukreiptus į šį neuroendokrininį žymenį.

Auroros kinazės inhibitoriai, pasinaudodami genomo nestabilumu ir mitozės kontrolinio taško defektais, veikia SCLC ląstelių linijas, įskaitant NCI-H69. MYC šeimos amplifikacija, esanti SCLC navikų pogrupyje, sukuria priklausomybę nuo MYC reguliuojamų kelių, į kuriuos galima nukreipti CDK7/9 inhibitorius arba BET bromodomeno inhibitorius. NCI-H69 leidžia įvertinti šias naujas tikslines strategijas.

PARP inhibitoriai SCLC navikams pasižymi nedideliu vienkartiniu aktyvumu, tačiau NCI-H69 ląstelėse jie sinergizuoja su DNR pažeidžiančia chemoterapija. Derinio loginis pagrindimas susijęs su ydingu SCLC atsaku į DNR pažeidimus, atsirandančiu dėl visuotinio RB1/TP53 praradimo. Remiantis ikiklinikiniais NCI-H69 ir panašių modelių duomenimis, šiuo metu atliekami klinikiniai tyrimai, kurių metu vertinami PARP inhibitorių deriniai SCLC atveju.

Imunoterapijos tyrimų taikymas

Neseniai įrodyta, kad imuninių kontrolės taškų inhibitoriai yra naudingi išgyvenamumui sergant ekstensyvios stadijos SCLC, todėl buvo patvirtinti atezolizumabo ir durvalumabo deriniai su chemoterapija. NCI-H69 leidžia tirti imunoterapijos mechanizmus ir biologinius žymenis SCLC biologijoje. PD-L1 raiška NCI-H69 ląstelėse padeda tirti kontrolinių taškų inhibitorių poveikį naviko ir imuninės sistemos sąveikai.

NCI-H69 ir imuninių efektorinių ląstelių ko-kultūrų sistemos modeliuoja naviko ir imuninės sistemos dinamiką, susijusią su atsaku į imunoterapiją. THP-1 ląstelės, diferencijuotos į makrofagus, yra mieloidinių ląstelių modeliai, o Jurkat E6.1 ląstelės leidžia atlikti T ląstelių sąveikos tyrimus. K562 ląstelės padeda atlikti NK ląstelių citotoksiškumo tyrimus, kuriais vertinamas įgimtosios imuninės sistemos nukreipimas į SCLC ląsteles.

CAR-T ląstelių terapijos metodus, nukreiptus į DLL3 ir kitus su SCLC susijusius antigenus, galima įvertinti naudojant NCI-H69 kaip taikinio ląsteles. Didelė DLL3 raiška NCI-H69 ląstelėse yra teigiama kontrolė į DLL3 nukreiptam CAR-T kūrimui. CAR-T veiksmingumo, citokinų išsiskyrimo ir T ląstelių išlikimo įvertinimas kartu su NCI-H69 ląstelėmis padeda vykdyti klinikinę plėtrą.

Ksenograftų modelio kūrimas

NCI-H69 ląstelės sukuria ksenograftus imunodeficitinėms pelėms, kurių spartaus augimo kinetika būdinga SCLC. Poodinė implantacija leidžia išmatuoti naviko tūrį ir įvertinti vaistų veiksmingumą. Švirkščiant į veną, susidaro plačios metastazės, atitinkančios kliniškai stebimą SCLC pacientų metastazių plitimą.

Ksenograftų tyrimai patvirtina in vitro vaistų jautrumo stebėjimus ir įvertina farmakokinetinius-farmakodinaminius ryšius in vivo sąlygomis. Spartus NCI-H69 ksenografto augimas leidžia jautriai nustatyti vaisto poveikį, bet reikalauja dažno stebėjimo ir tikslaus gydymo planavimo. Vėluojančio naviko augimo ir išgyvenamumo galutiniai rodikliai įvertina kandidatų į vaistus veiksmingumą.

NCI-H69 ksenograftų palyginimas su pacientų ksenograftų (PDX) modeliais, gautais iš SCLC sergančių pacientų, patvirtina įvairių modelių sistemų išvadas. PDX modeliai išlaiko didesnį heterogeniškumą, atspindintį pacientų navikus, tačiau jiems reikia daugiau išteklių. Ląstelių linijų ir PDX modelių derinys sustiprina ikiklinikinius įrodymus, pagrindžiančius klinikinę plėtrą.

SCLC tyrimų kokybės užtikrinimas

Autentiškos ir neužterštos NCI-H69 atsargos yra labai svarbios siekiant atkurti SCLC tyrimus. Ląstelių linijos autentiškumo nustatymas naudojant STR profilį patvirtina NCI-H69 tapatybę ir atskiria ją nuo kitų SCLC ląstelių linijų laboratorijoje. Šis patikrinimas turėtų būti atliekamas prieš pradedant svarbias mokslinių tyrimų programas ir periodiškai per ilgesnį auginimą.

Mikoplazmų tyrimas užkerta kelią klaidinančiam užterštumo poveikiui jautrumo vaistams ir genų raiškos tyrimams. Mikoplazma užkrėstos NCI-H69 ląstelės gali pasižymėti pakitusia augimo kinetika ir atsako į vaistus profiliais. Reguliarus testavimas per visą eksperimentų laikotarpį padeda išlaikyti kultūros vientisumą.

Dokumentacija, kurioje nurodomas išėjimo skaičius, leidžia įvertinti genetinį nuokrypį, galintį pakeisti ląstelių elgseną per ilgesnį auginimo laikotarpį. Ankstyvosios eilės ląstelių atsargos geriau atitinka pirmines naviko charakteristikas. Krioprezervuotos daugkartinių eigų ląstelės leidžia grįžti prie ankstyvųjų eigų ląstelių, kai išryškėja nuokrypis.

Išvada

NCI-H69 yra patikimas ir išsamiai apibūdintas smulkiųjų ląstelių plaučių vėžio tyrimų modelis. Dėl klasikinių SCLC molekulinių savybių, būdingos suspensijos augimo morfologijos ir gerai dokumentuotų atsako į chemoterapiją modelių ši ląstelių linija yra vertinga vaistų atradimui ir mechanizmo tyrimams. NCI-H69 rezultatų integravimas su kitais SCLC modeliais ir iš pacientų gautomis sistemomis užtikrina, kad bus atliekami aktualūs tyrimai, kuriais bus plėtojamos šios agresyvios piktybinės ligos gydymo galimybės.