使用细胞系进行生物打印：从二维到三维打印组织结构

使用细胞系进行生物打印：从二维到三维打印组织结构

三维生物打印技术是一项革命性技术，可实现活细胞、生物材料和生物活性分子的精确空间沉积，从而制造出具有确定结构的组织构建体，再现原生组织结构。在 Cytion，我们认识到，与原代细胞相比，成熟的细胞系为生物打印应用提供了显著优势，包括无限的扩增能力、良好的行为特征、稳定的质量以及更少的伦理限制。从传统的二维单层培养过渡到利用细胞和细胞系的三维生物打印构建体，需要仔细考虑生物墨水配方、打印方法、沉积过程中细胞对机械应力的反应以及打印后的成熟方案。这种先进的制造方法能够制造出复杂的组织模型，用于药物筛选、疾病建模和基础生物学研究，并对细胞组成、空间组织和微结构特征进行前所未有的控制。

生物打印技术	机制	分辨率	细胞活力	最佳应用
挤压式	通过喷嘴以气动或机械方式分配含有细胞的生物墨水	100-500 μm	40-95% 取决于压力和喷嘴尺寸	具有高细胞密度的大型结构；多材料打印；具有成本效益的系统
喷墨/液滴式	含细胞液滴的热喷射或压电喷射	50-300 μm	通过优化参数达到 80-95	高通量打印；精确的空间图案化；低粘度生物墨水
激光辅助	激光诱导细胞从供体基底向接收基底的正向转移	10-50 μm	激光参数适当时为 85-99	高分辨率特征；单细胞精度；需要温和沉积的敏感细胞
立体光刻/DLP	逐层光聚合含有细胞的光交联水凝胶	25-100 μm	75-95% 取决于光引发剂和曝光量	复杂几何形状；快速制造；血管网络；高通量生产

生物墨水配方和流变特性

生物墨水的配方是决定生物打印成功与否的最关键因素，需要在打印特性、细胞兼容性和打印后的结构完整性之间取得谨慎的平衡。理想的生物墨水具有剪切稀化特性，在挤出过程中，粘度会在施加剪切应力的情况下降低，然后在沉积时迅速恢复，以保持打印结构的真实性。根据打印方法的不同，粘度通常在 30 到 6×10⁷ mPa-s 之间，与需要低粘度（3-12 mPa-s）来形成液滴的喷墨方法相比，基于挤压的系统需要更高的粘度（≥1000 mPa-s）来保持形状。生物墨水中的细胞浓度通常为每毫升 1×10⁶ 至 2×10⁷，从而在组织形成所需的足够细胞密度与打印喷嘴的潜在堵塞和材料粘度过高之间取得平衡。常见的生物墨水基础材料包括藻酸盐、明胶、甲基丙烯酸明胶（GelMA）、透明质酸和琼脂糖，通常以多组分配方组合，以优化机械性能、降解动力学和生物活性。对 Cytion 的细胞和细胞系而言，生物墨水成分的经验优化至关重要，以适应细胞类型的特定粘附要求和打印过程中对机械应力的敏感性。

基于挤压的生物打印系统

基于挤压的生物打印技术是目前应用最广泛的技术，因为它的设备成本相对较低，与高粘度生物墨水和高细胞密度兼容，并具有可扩展性，可制造厘米级的构建体。这些系统通过直径从 100 到 500 微米不等的圆柱形喷嘴喷射含细胞材料的连续细丝，通过气压、机械螺杆驱动位移或活塞驱动控制沉积。细胞在喷嘴挤压过程中受到的剪切应力是一个主要问题，根据流体力学原理，剪切应力的大小取决于喷嘴直径、施加的压力和生物墨水的粘度。细胞在喷嘴壁处受到的剪切应力达到峰值，如果过大，可能会导致膜损伤、存活率降低和基因表达谱改变。优化需要平衡喷嘴直径和挤出压力，以达到理想的分辨率，同时保持细胞存活率通常在 80% 以上。多材料生物打印功能可实现不同细胞类型和材料的同时或连续沉积，从而促进具有空间定义成分的异质组织构建物的制造。同轴喷嘴配置可直接打印出有利于血管形成的空心管状结构，随后去除核心材料，形成内衬内皮细胞的专利管腔。

喷墨和液滴生物打印

喷墨生物打印技术源自商业文档打印系统，可精确沉积皮升体积的含细胞液滴，提供高分辨率空间图案，打印速度快，适合高通量应用。热喷墨系统通过电阻加热元件产生气泡，形成压力脉冲将液滴从打印头喷出，而压电系统则利用电压引起的压电晶体变形产生声波推动液滴。由于瞬时温度升高，细胞存活率问题最初限制了热喷墨方法的采用，但经过优化的系统可将热损伤降至最低，温度保持在临界阈值以下，曝光持续时间限制在微秒级。压电系统可避免热应力，但需要仔细调整声学参数，以平衡液滴形成的可靠性和对细胞的机械应力。喷墨系统的生物墨水粘度必须保持在大约 12 mPa-s 以下才能形成液滴，这就限制了与挤出法相比的材料选择，而且通常需要沉积后交联以实现结构稳定性。喷墨生物打印的高精度和高产量使其特别适用于需要多种细胞类型的确定空间模式的应用，例如共培养模型或使用HeLa 细胞和其他成熟细胞系进行药物筛选的梯度生成。

激光辅助生物打印和高分辨率图案化

激光辅助生物打印（LAB）又称激光诱导正向转移，是生物打印技术中空间分辨率最高的技术，能以微米级精度沉积单个细胞或小细胞群。LAB 系统由一个脉冲激光源、一个涂有能量吸收材料和含细胞生物墨水的供体载玻片以及一个紧靠供体载玻片下方的接收基底组成。聚焦的激光脉冲使能量吸收层汽化，产生高压气泡，将含细胞的液滴从供体载玻片上推进到接收基底上，并实现精确的空间控制。通过优化参数，可实现 10-50 微米的分辨率和超过 95% 的细胞存活率，大大优于其他生物打印模式。LAB 的无喷嘴特性消除了与挤压相关的剪切应力，避免了在打印高粘度或高密度细胞悬浮液时困扰喷嘴系统的堵塞问题。不过，LAB 系统需要精密的光学设备，并对激光参数（包括波长、脉冲持续时间、能量密度和焦斑大小）进行仔细优化，以平衡打印可靠性与细胞存活率之间的关系。LAB 能够打印出单细胞分辨率的细胞，这使得它在需要精确空间组织的应用中尤为重要，例如神经元-胶质细胞共培养或研究确定距离的细胞-细胞信号传导。

立体光刻和数字光处理

立体光刻（SLA）和数字光处理（DLP）生物打印技术利用逐层光聚合含细胞的光交联水凝胶来快速制造复杂的三维几何图形，分辨率可达 25-100 微米。基于沉积的方法通过按顺序放置材料来构建结构，而基于光的方法则是同时交联整个层，从而大大缩短了复杂几何结构的制造时间。DLP 系统使用数字微镜阵列投射与整个层横截面相对应的光图案，而 SLA 系统则扫描聚焦激光束来跟踪层图案，DLP 通常打印速度更快。光交联生物墨水含有光引发剂，在光照射下会产生活性物质，引发甲基丙烯酸明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯或甲基丙烯酸透明质酸等水凝胶前体的聚合或交联。细胞存活率主要取决于光引发剂浓度、光照强度和照射时间，因为光引发过程中产生的活性氧会损伤细胞成分。通过使用与细胞兼容的可见光光引发剂（苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂）、低光引发剂浓度（0.05-0.5%）和最小化光照射，优化后的系统可实现 75-95% 的印刷后存活率。SLA/DLP 能够快速制造复杂的血管网络和错综复杂的组织结构，因此特别适合用于片上器官应用和组织工程，但需要兼容的光交联材料和谨慎的光聚合动力学管理。

打印后的成熟和培养优化

生物打印构建体在制造完成后通常会立即表现出有限的细胞-细胞相互作用、极少的细胞外基质沉积以及由生物墨水材料而非生物组织特征主导的机械性能。打印后的成熟培养至关重要，可使细胞从最初的球形形态扩展开来，建立细胞-细胞连接，分泌和组织内源性细胞外基质，并发展组织特异性功能。根据细胞类型、构建复杂程度和预期应用的不同，培养时间要求从几天到几周不等，代谢活跃的细胞通常需要更频繁地更换培养基，以防止营养耗竭和代谢物积累。细胞培养基中添加组织特异性生长因子、激素和其他生物活性分子可加速成熟并增强功能特性，但具体要求取决于细胞类型和所需表型。通过灌注流、循环拉伸或压缩进行机械刺激，可促进对机械敏感的细胞类型的组织成熟和功能发育，模拟生理负荷条件。对于含有生物可降解成分的生物墨水来说，机械性能的时间演变反映了基质降解和细胞分泌基质的积累，这就要求在降解动力学和基质沉积率之间取得谨慎的平衡。通过形态学评估、基因表达分析和功能测定来监测成熟度，可以优化培养条件，并为生物打印组织模型的实验分析确定适当的时间点。

在药物筛选和疾病建模中的应用

与传统的二维培养相比，利用 Cytion 目录中的成熟细胞系构建的生物打印组织为药物化合物筛选和疾病建模提供了功能强大的平台，并提高了生理相关性。由于能够精确控制细胞组成、空间组织和微观结构特征，因此能够对结构-功能关系进行系统研究，并生成适合高通量筛选工作流的可重复组织模型。用肿瘤细胞系、基质成纤维细胞和内皮细胞按确定的空间排列进行生物打印的癌症模型能更好地再现肿瘤微环境特征，包括缺氧梯度、异质性药物渗透和影响治疗反应的基质-肿瘤相互作用。与传统培养物相比，在确定的结构中加入肝细胞系的肝组织模型显示出更强的细胞色素 P450 表达和代谢功能，从而提高了肝毒性筛选的预测准确性。具有精确神经元-胶质细胞组织结构的生物打印神经组织模型可用于研究神经退行性疾病机制和筛选神经保护化合物。与人工生成的三维培养物相比，生物打印的可重复性优势有利于实现标准化，这对监管机构的认可和整合到药物开发管道中至关重要，但对照体内结果进行验证对建立预测能力的信心仍然至关重要。