SNU Cell Lines in Immunotherapy Biomarker Discovery

SNU ląstelių linijos imunoterapijos biologinių žymenų nustatymui

Patikimų biožymenų nustatymas tebėra vienas svarbiausių iššūkių imunoterapijos vystymo srityje. Seulo nacionalinio universiteto (SNU) ląstelių linijos, gautos iš Korėjos skrandžio ir storosios žarnos vėžiu sergančių pacientų, tapo neįkainojama biomarkerių paieškos priemone dėl gerai apibūdintų genetinių profilių, įvairių mutacijų ir užfiksuoto atsako į imunomoduliatorius. Šios ląstelių linijos suteikia mokslininkams kliniškai tinkamų modelių, kurie sumažina atotrūkį tarp laboratorinių tyrimų rezultatų ir pacientų gydymo rezultatų, ir leidžia sistemingai nustatyti imunoterapijos atsaką prognozuojančius žymenis.

Pagrindinės išvados

• SNU ląstelių linijos yra genetiškai įvairūs modeliai, atspindintys Azijos pacientų populiacijas imunoterapijos tyrimuose
• Šios ląstelių linijos išreiškia skirtingus PD-L1, MSI statuso ir naviko mutacijų kiekius, kurie labai svarbūs kontrolinių taškų inhibitorių tyrimams
• SNU skrandžio vėžio modeliai leidžia nustatyti biomarkerius, pagal kuriuos galima prognozuoti atsaką į anti-PD-1/PD-L1 terapiją
• Integruotas SNU linijų genominis ir proteominis profiliavimas atskleidžia naujus imunoterapijos taikinius
• SNU ląstelių linijų paneliai palengvina didelės apimties atrankinę patikrą dėl imuninių kontrolinių taškų raiškos modelių

SNU ląstelių linijų genetinė įvairovė imunoterapijos modeliavimui

SNU ląstelių linijų kolekcija yra genetiškai heterogeniška grupė, atspindinti Azijos skrandžio ir storosios žarnos vėžiu sergančių pacientų populiacijų molekulinę įvairovę. Šiose Seulo nacionalinėje universitetinėje ligoninėje sukurtose ląstelių linijose aptinkami skirtingi mutacijų profiliai, apimantys onkogenus, naviko slopintojus ir DNR taisymo kelio genus. Ši genetinė įvairovė yra labai svarbi imunoterapijos biožymenų tyrimams, nes leidžia sistemingai susieti konkrečius genomo pokyčius su imunoterapijos atsako modeliais.

SNU skrandžio vėžio ląstelių linijos pasižymi skirtingu mikrosatelitinio nestabilumo (MSI) statusu, kuris lemia kontrolinių taškų inhibitorių veiksmingumą. MSI aukštas atsparumas navikams pasižymi didesne neoantigenų gamyba ir imuninių ląstelių infiltracija, todėl MSI statusas yra patvirtintas skrandžio vėžio anti-PD-1 terapijos biomarkeris. Turint tiek MSI turinčių, tiek mikrosatelitinio stabilumo (MSS) SNU ląstelių linijų, galima atlikti lyginamuosius tyrimus, kurie leidžia išsiaiškinti skirtingo atsako į imunoterapiją mechanistinį pagrindą.

Atlikdami išsamius skrandžio vėžio tyrimus, mokslininkai dažnai naudoja tokius ląstelių modelius kaip AGS ląstelės kartu su SNU linijomis, kad sudarytų lyginamąsias grupes. KATO-III ląstelės yra papildomi difuzinio tipo skrandžio vėžio modeliai, o MKN-45 ląstelės ir MKN-74 ląstelės - žarnyno tipo skrandžio adenokarcinomos modeliai.

PD-L1 raiškos profiliavimas SNU ląstelių linijose

Programuotos mirties 1ligando (PD-L1) raiška yra kertinis biomarkeris imunoterapijos pacientų atrankai. SNU ląstelių linijos pasižymi įvairiais konstitutyvios ir indukuojamos PD-L1 raiškos lygiais, todėl tyrėjai gali naudotis modeliais, apimančiais visą kliniškai stebimą PD-L1 pozityvumo spektrą. Šis kintamumas leidžia atlikti mechanistinius tyrimus, kuriais tiriamas PD-L1 raiškos reguliavimas ir jo ryšys su atsaku į kontrolinių taškų blokadą.

Interferono gama (IFN-γ) stimuliavimas SNU ląstelių linijose atskleidžia skirtingus PD-L1 indukcijos modelius, kurie koreliuoja su JAK-STAT kelio vientisumu. Ląstelių linijos, kuriose yra JAK1/2 mutacijų, po IFN-γ poveikio pasižymi sutrikusia PD-L1 reguliacija, taip modeliuodamos atsparumo mechanizmą, pastebėtą imunoterapijai atspariuose pacientuose. Šis fenotipas leidžia ieškoti derinių strategijų, įveikiančių PD-L1 indukcijos defektus.

Imunologiniams naviko ir imuninės sistemos sąveikos tyrimams reikalingi tinkami imuninių ląstelių modeliai. THP-1 ląstelės yra monocitų ir makrofagų modeliai, skirti bendrakultūriniams tyrimams, kuriais vertinama naviko ir imuninių ląstelių sąveika. Jurkat E6.1 ląstelės yra T ląstelių modeliai, skirti kontrolinių taškų inhibitorių poveikiui T ląstelių aktyvacijai vertinti, kai yra PD-L1 ekspresuojančių navikinių ląstelių.

Naviko mutacijų naštos vertinimas naudojant SNU grupes

Naviko mutacijų našta (TMB) tapo daugelio tipų navikų atsako į imunoterapiją prognoziniu biomarkeriu. SNU ląstelių linijos, apimančios mažo, vidutinio ir didelio TMB kategorijas, leidžia sistemingai įvertinti mutacijų apkrovos ir imunogeniškumo ryšį. Atlikus SNU grupių viso egzomo sekoskaitą, nustatytos etaloninės TMB vertės, kurias lengviau palyginti su klinikiniais mėginiais.

Didelio TMB SNU ląstelių linijos sukuria daug numatomų neoantigenų, galinčių sukelti T ląstelių atsaką. Neoantigenų prognozavimo algoritmai, taikomi SNU genominiams duomenims, leidžia nustatyti kandidatus į epitopus, kurie bus naudojami T ląstelių atpažinimo patvirtinimo tyrimuose. Šis metodas leidžia nustatyti imunogenines mutacijas, kurios gali tapti terapiniais taikiniais individualizuotoms neoantigenų vakcinoms arba adaptyvinei ląstelių terapijai.

Sąsaja tarp TMB ir atsako į kontrolinio taško inhibitorius SNU ląstelių linijose buvo patvirtinta atliekant in vitro bendrakultūrinius tyrimus ir in vivo tyrimus naudojant imunokompetentinių pelių modelius. K562 ląstelės naudojamos kaip taikinio ląstelės natūraliųjų ląstelių žudikių citotoksiškumo tyrimams, kurie papildo T ląstelių tyrimus, o HL-60 ląstelės yra mielominės linijos modeliai naviko mikroaplinkai tirti.

Integruotas genominis ir proteominis biomarkerių atradimas

Daugiakomponentis SNU ląstelių linijų profiliavimas atskleidžia kandidatus į biomarkerius, kurie yra ne tik nustatyti žymenys, tokie kaip PD-L1 ir MSI statusas. Atlikus transkriptominę analizę nustatomi genų raiškos požymiai, susiję su T ląstelių išstūmimu, atsaku į interferoną ir epitelio-mezenchiminiu perėjimu, pagal kuriuos galima prognozuoti imunoterapijos rezultatus. Šie požymiai leidžia taikyti pacientų stratifikavimo strategijas, kurios pagerina vieno žymens metodus.

ŠNV ląstelių linijų proteominis profiliavimas kiekybiškai nustato paviršiaus imunomoduliacines molekules, įskaitant papildomus kontrolės taškų receptorius (TIM-3, LAG-3, TIGIT), ko-stimuliuojančias molekules (CD80, CD86, ICOS-L) ir antigeno pateikimo mechanizmo komponentus. Šis išsamus paviršiaus imunomo apibūdinimas leidžia nustatyti kombinuotos imunoterapijos taikinius ir prognozuoti jautrumą naujiems kontrolinių taškų inhibitoriams.

Ląstelių kultūrų optimizavimui reikalingos tinkamos terpės formulės. RPMI 1640 terpė užtikrina standartines kultivavimo sąlygas limfocitais pagrįstiems tyrimams, o DMEM palaiko epitelio vėžio ląstelių linijų palaikymą. Tinkamas kriokonservavimas su užšaldymo terpe CM-1 užtikrina ląstelių linijos vientisumą per visą eksperimentų laiką.

Didelio našumo kontrolinių taškų raiškos modelių atrankinė patikra

SNU ląstelių linijų grupė leidžia taikyti keičiamo masto atrankinės patikros metodus, kad būtų galima nustatyti kontrolinių taškų raiškos modelius, pagal kuriuos galima prognozuoti imunoterapijos atsaką. Automatizuotos srauto citometrijos ir didelio turinio vaizdavimo platformos vienu metu kiekybiškai įvertina daugelį kontrolinių taškų molekulių visoje SNU grupėje, todėl gaunami išsamūs imunofenotipiniai duomenų rinkiniai, kuriuos galima analizuoti mašininiu mokymusi.

CRISPR pagrindu atliekami genetiniai tyrimai SNU ląstelių linijose identifikuoja genus, reikalingus kontrolinių taškų raiškai ir imuninės sistemos vengimui. Atlikus genomo funkcijų praradimo atrankinius tyrimus atskleidžiami nauji PD-L1 raiškos ir antigeno pateikimo reguliatoriai, kurie yra terapiniai taikiniai imunoterapijos sensibilizacijai. Šias genetines priklausomybes galima patvirtinti taikant farmakologinius metodus su esamais junginiais.

Virškinimo trakto vėžio tyrimams, neapsiribojant tik skrandžio modeliais, storosios žarnos vėžio ląstelių linijos išplečia atrankinių tyrimų galimybes. HCT116 ląstelės - tai MSI didelio kiekio storosios žarnos vėžio modeliai, o Caco-2 ląstelės ir DLD-1 ląstelės - papildomi storosios žarnos adenokarcinomos modeliai, turintys skirtingą genetinį foną. SW620 ląstelės, gautos iš metastazavusios ligos, leidžia tirti imunoterapiją metastazavus.

Iš SNU gautų biologinių žymenų klinikinis pritaikymas

Kandidatus į biomarkerius, nustatytus SNU ląstelių linijose, prieš taikant juos pacientų priežiūrai, reikia kruopščiai patvirtinti klinikinėse kohortose. Atliekant retrospektyvinę iš SNU gautų biomarkerių analizę imunoterapijos klinikinių tyrimų mėginiuose, nustatomas prognozavimo tikslumas ir nustatomos optimalios ribinės vertės. Šio patvirtinimo proceso metu pirmenybė teikiama biomarkeriams, kurie pasižymi patikimu veikimu įvairiose pacientų populiacijose.

SNU ląstelių linijų kolekcija padėjo nustatyti šiuo metu kliniškai vertinamus biomarkerius. Tarp jų yra genų raiškos požymiai, kuriais prognozuojamas atsakas į kontrolės taškų inhibitorius, cirkuliuojantys biomarkeriai, aptinkami pacientų kraujo mėginiuose, ir vaizdo biomarkeriai, kuriuos galima įvertinti neinvaziniais metodais. Perspektyvūs klinikiniai tyrimai, kuriuose naudojami SNU išvesti biomarkeriai, yra tobulinami.

Biomarkeriams atrasti reikia autentiškų ląstelių linijų ir standartizuotų protokolų. Ląstelių linijų autentiškumo nustatymo paslaugos tikrina ląstelių linijų tapatybę, naudojant STR profiliavimą, o mikoplazmos tyrimai užtikrina kultūrų vientisumą. Šios kokybės kontrolės priemonės yra būtinos norint gauti atkuriamus biomarkerių duomenis, tinkamus pateikti reguliavimo institucijoms.

Išvada

SNU ląstelių linijos yra svarbios priemonės imunoterapijos biomarkeriams atrasti, nes siūlo genetiškai skirtingus modelius, kurie atspindi Azijos skrandžio ir storosios žarnos vėžiu sergančių pacientų populiacijų molekulinį heterogeniškumą. Sistemingai nustatydami PD-L1 raiškos, MSI statuso, naviko mutacijų naštos ir daugiakomponenčių biomarkerių profilius, tyrėjai gali nustatyti prognozinius žymenis, kurie pagerins pacientų atranką imunoterapijai. Toliau plečiant SNU ląstelių linijų apibūdinimą ir patvirtinant SNU gautus biomarkerius klinikinėse kohortose, laboratorinių atradimų perkėlimas į geresnius pacientų rezultatus paspartės.