Cardiac Stem Cells in Myocardial Regeneration Studies

Стовбурові клітини серця в дослідженнях регенерації міокарда

Обмежена регенеративна здатність серця дорослих ссавців після інфаркту міокарда спонукає до інтенсивних досліджень біології серцевих стовбурових клітин та регенеративної терапії. Поки тривають дебати щодо існування та регенеративного потенціалу ендогенних стовбурових клітин серця, різні клітинні популяції досліджуються на предмет їх здатності відновлювати пошкоджений міокард. Розуміння біології клітин-попередників серця та розробка ефективних методів клітинної терапії залишається головною метою для вирішення глобальної проблеми серцевої недостатності, спричиненої ішемічною хворобою серця.

Основні висновки

• На основі поверхневих маркерів та функціональних властивостей було ідентифіковано декілька популяцій клітин-попередників кардіоміоцитів
• c-Kit+ клітини-попередники серця викликали початковий ентузіазм, але демонструють обмежену диференціацію кардіоміоцитів in vivo
• Клітини, отримані з кардіосфери, демонструють паракринні переваги в клінічних дослідженнях, незважаючи на обмежене приживлення
• Кардіоміоцити, отримані з індукованих плюрипотентних стовбурових клітин, пропонують масштабовані джерела клітин з визначеною диференціацією
• Паракринні механізми можуть опосередковувати переваги відновлення серця незалежно від заміни клітин

Ендогенні клітини-попередники серця

Виявлення c-Kit⁺ клітин-попередників серця (CPC) у серці дорослої людини викликало величезний ажіотаж щодо регенерації серця. Повідомлялося, що ці клітини, ідентифіковані за експресією рецептора фактора стовбурових клітин c-Kit (CD117), диференціюються в кардіоміоцити і регенерують інфарктний міокард. Однак подальші дослідження з відстеження лінії показали, що c-Kit⁺ КПК мінімально сприяють утворенню нових кардіоміоцитів, генеруючи натомість ендотеліальні клітини та фібробласти.

Sca-1⁺ кардіальні попередники представляють іншу популяцію, ідентифіковану в серці гризунів. Ці клітини демонструють кардіоміогенний потенціал in vitro, але, як і c-Kit⁺ клітини, демонструють обмежену диференціацію до функціональних кардіоміоцитів in vivo. Відсутність людського ортологу Sca-1 ускладнює застосування результатів дослідження Sca-1⁺ CPC в клінічних умовах.

Клітини побічної популяції, ідентифіковані за допомогою витікання барвника Hoechst, представляють третю популяцію серцевих попередників. Ці клітини, що експресують АТФ-зв'язуючий касетний транспортер ABCG2, демонструють багатолінійний потенціал, але не просунулися до клінічного розвитку. Суперечки щодо справжньої регенеративної здатності ендогенних КПК змістили фокус у бік екзогенних клітинних джерел та паракринних механізмів.

Клітинна терапія на основі кардіосфер

Кардіосфери являють собою самозбірні кластери клітин, отримані з експлантатів серцевої тканини. При культивуванні у вигляді сфероїдів ці клітини експресують маркери попередників і демонструють потенціал багатолінійної диференціації. Кардіосферні клітини (CDC), отримані з первинних кардіосфер, пройшли клінічні випробування для лікування інфаркту міокарда та серцевої недостатності.

Дослідження CADUCEUS продемонструвало, що інфузія CDC зменшує розмір рубця і збільшує життєздатний міокард у постінфарктних пацієнтів. Однак функціональне покращення, виміряне за фракцією викиду, було скромним. Механізм позитивного ефекту є переважно паракринним, оскільки фактори, що виділяються CDC, сприяють ангіогенезу, зменшують запалення і потенційно стимулюють ендогенну репарацію, а не пряму заміну клітин.

Виробництво CDC включає біопсію ендоміокарда, культивування тканинного експлантату і формування кардіосфери в суспензії з подальшою експансією у вигляді адгезивних CDC. Цей процес дозволяє отримувати аутологічні клітини з біоптатів пацієнтів, хоча терміни виготовлення та варіабельність створюють проблеми для гострих застосувань.

Кардіоміоцити, отримані з індукованих плюрипотентних стовбурових клітин

Індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (iPSC), диференційовані в кардіоміоцити (iPSC-CM), пропонують масштабоване, визначене джерело клітин для регенерації серця. Протоколи спрямованої диференціації з використанням модуляції шляху Wnt ефективно генерують кардіоміоцити, що б'ються, з iPSC. Ці клітини експресують кардіологічні маркери та демонструють функціональні властивості, включаючи обробку кальцію та скоротливість.

трансплантація iPSC-CM у тваринних моделях демонструє приживлення та часткову електричну інтеграцію з міокардом хазяїна. Однак неповне дозрівання iPSC-КМ порівняно з дорослими кардіоміоцитами створює ризик аритмії через автоматизм та гетерогенність провідності. Стратегії покращення дозрівання та електричної інтеграції iPSC-КМ залишаються активними напрямками досліджень.

Алогенні продукти iPSC-CM від HLA-гомозиготних донорів можуть забезпечити готову клітинну терапію, уникаючи виготовлення під конкретного пацієнта. В Японії та інших країнах проводяться клінічні дослідження з оцінки безпеки та ефективності застосування iPSC-CM при серцевій недостатності, що відкриває нові можливості кардіологічної терапії плюрипотентними стовбуровими клітинами.

Застосування мезенхімальних стовбурових клітин в кардіології

Мезенхімальні стовбурові клітини демонструють кардіопротекторні ефекти, головним чином, через паракринні механізми, а не через диференціювання кардіоміоцитів. Фактори, що секретуються МСК, включаючи VEGF, IGF-1 та HGF, сприяють ангіогенезу та виживанню клітин в ішемізованому міокарді. Протизапальні цитокіни зменшують пошкоджуюче запалення після інфаркту.

Мезенхімальні стовбурові клітини людини - кістковий мозок (HMSC-BM ) є стандартним джерелом МСК для кардіологічних досліджень. Клінічні дослідження з використанням МСК кісткового мозку для лікування інфаркту міокарда показують помірні переваги при відмінному профілі безпеки. Мезенхімальні стовбурові клітини людини - жирова тканина - є альтернативним джерелом з потенційно кращими паракринними властивостями для кардіологічних досліджень.

Серцева диференціація МСК залишається обмеженою, незважаючи на повідомлення in vitro про кардіоміогенний потенціал. Терапевтична користь МСК в кардіології обумовлена переважно паракринними ефектами, а не заміщенням клітин. Таке механістичне розуміння змістило фокус на оптимізацію доставки секретома МСК, а не на посилення диференціювання.

Паракринні механізми відновлення серця

Екзосоми та мікровезикули, що секретуються серцевими прогеніторними клітинами та МСК, опосередковують паракринні ефекти. Ці позаклітинні везикули містять білки, мРНК та мікроРНК, які модулюють функцію клітин-реципієнтів. Екзосоми, отримані з CDC, відтворюють переваги відновлення серця, що спостерігаються при трансплантації цілих клітин, що свідчить на користь безклітинних терапій на основі екзосом.

Стимулювання ангіогенезу покращує перфузію ішемізованого міокарда. VEGF, bFGF та ангіопоетини, що секретуються трансплантованими клітинами або доставляються за допомогою екзосом, стимулюють утворення нових кровоносних судин. Посилена васкуляризація сприяє виживанню кардіоміоцитів та потенційній ендогенній регенерації.

Антифіброзні ефекти зменшують утворення рубців і зберігають серцеву функцію. Секретовані фактори пригнічують активацію фібробластів і відкладення колагену. Цей механізм може пояснити поліпшення структури та функції серця, що спостерігається без значного приживлення клітин.

Протоколи культивування та розширення

Ізоляція серцевих прогеніторних клітин зазвичай передбачає ферментативну дисоціацію серцевої тканини з подальшим відбором за маркерами або диференційованим адгезійним культивуванням. Ізоляція клітин c-Kit⁺ здійснюється за допомогою магнітного відбору, тоді як формування кардіосфери відбувається спонтанно в відповідних умовах суспензійного культивування.

Середовище DMEM/Ham's F12, доповнене факторами росту, забезпечує стандартні умови культивування для розширення серцевих прогеніторних клітин. Спеціалізовані середовища для серцевих стовбурових клітин, що містять визначені фактори, оптимізують розширення, зберігаючи властивості прогеніторів. Заморожувальне середовище CM-1 дозволяє криоконсервувати розширені серцеві прогенітори.

Контроль якості продуктів серцевих клітин вимагає функціональної оцінки, що виходить за межі характеристики поверхневих маркерів. Вимірювання транзиторних змін кальцію, електрофізіологічні записи та аналізи скоротливості підтверджують функцію кардіоміоцитів. Аутентифікація клітинної лінії та тестування на мікоплазму забезпечують цілісність продукту для досліджень та клінічного застосування.

Методи та терміни доставки

Внутрішньоміокардіальна ін'єкція забезпечує пряме введення в цільову тканину, але вимагає інвазивних хірургічних або катетерних підходів. Утримання клітин у місцях ін'єкції є обмеженим, і більшість клітин втрачається протягом декількох годин або днів через механічне вимивання та загибель клітин у несприятливому середовищі інфаркту.

Внутрішньокоронарна інфузія забезпечує менш інвазивне введення, але залежить від трансендотеліальної міграції для міокардіального хомінгу. Цей шлях забезпечує ширше розподілення, але ще нижчу ретенцію, ніж пряма ін'єкція. Повторні інфузії можуть компенсувати погану початкову ретенцію.

Час доставки клітин впливає на результати. Гостра доставка відразу після інфаркту стикається з несприятливим запальним середовищем, але може надати максимальну можливість для втручання. Затримка доставки після стихання гострого запалення може поліпшити виживання клітин, але пропустити терапевтичне вікно для отримання максимальної користі.

Майбутні напрямки

Пряме перепрограмування серця перетворює фібробласти на клітини, подібні до кардіоміоцитів, in situ без трансплантації клітин. Комбінації транскрипційних факторів (Gata4, Mef2c, Tbx5) або малі молекули індукують долю кардіоміоцитів у серцевих фібробластах. Цей підхід дозволяє уникнути проблем, пов'язаних з трансплантацією клітин, але стикається з перешкодами щодо ефективності та безпеки.

Комбіновані підходи, що поєднують клітинну терапію з біоматеріальними каркасами, факторами росту та електричною стимуляцією, можуть покращити результати відновлення серця. Інженерні підходи, що створюють серцеві пластири з організованою клітинною архітектурою та судинною системою, вирішують обмеження підходів, що базуються на ін'єкції клітин.

Висновок

Дослідження серцевих стовбурових клітин еволюціонували від початкового ентузіазму щодо регенерації за допомогою ендогенних прогеніторних клітин до більш нюансованого розуміння паракринних механізмів та проблем справжньої регенерації серця. Хоча заміна кардіоміоцитів залишається амбітною метою, сучасні дані підтверджують переваги паракринної регенерації з різних клітинних джерел. Кардіоміоцити, отримані з iPSC, є найбільш перспективним шляхом до функціональної заміни клітин, але для цього потрібно вирішити проблеми дозрівання та інтеграції. Подальші дослідження, що просувають як підходи до заміщення клітин, так і паракринні підходи, в кінцевому підсумку забезпечать ефективні регенеративні методи лікування для пацієнтів із серцевою недостатністю.