Cardiac Stem Cells in Myocardial Regeneration Studies

Kmeňové bunky srdca v štúdiách regenerácie myokardu

Obmedzená regeneračná schopnosť srdca dospelých cicavcov po infarkte myokardu je dôvodom intenzívneho výskumu biológie srdcových kmeňových buniek a regeneračných terapií. Hoci sa naďalej diskutuje o existencii a regeneračnom potenciáli endogénnych srdcových kmeňových buniek, skúmala sa schopnosť rôznych bunkových populácií opravovať poškodený myokard. Pochopenie biológie srdcových progenitorových buniek a vývoj účinných terapií založených na bunkách zostáva hlavným cieľom pri riešení globálnej záťaže srdcového zlyhávania v dôsledku ischemickej choroby srdca.

Kľúčové poznatky

• Na základe povrchových markerov a funkčných vlastností boli identifikované viaceré populácie progenitorov srdca
• c-Kit+ srdcové progenitorové bunky vyvolali počiatočné nadšenie, ale vykazujú obmedzenú diferenciáciu kardiomyocytov in vivo
• Bunky odvodené z kardiosféry vykazujú parakrinné výhody v klinických štúdiách napriek obmedzenej ingraftácii
• Kardiomyocyty odvodené z indukovaných pluripotentných kmeňových buniek ponúkajú škálovateľné zdroje buniek s definovanou diferenciáciou
• Parakrinné mechanizmy môžu sprostredkovať výhody pri obnove srdca nezávisle od náhrady buniek

Endogénne srdcové progenitorové bunky

Identifikácia c-Kit⁺ srdcových progenitorových buniek (CPC) v dospelom srdci vyvolala obrovské nadšenie pre regeneráciu srdca. Tieto bunky, identifikované na základe expresie receptora pre faktor kmeňových buniek c-Kit (CD117), sa údajne diferencovali na kardiomyocyty a regenerovali infarktový myokard. Následné štúdie sledovania línií však odhalili, že c-Kit⁺ CPC prispievajú k tvorbe nových kardiomyocytov minimálne a namiesto toho vytvárajú endotelové bunky a fibroblasty.

Sca-1⁺ srdcové progenitory predstavujú ďalšiu populáciu identifikovanú v srdciach hlodavcov. Tieto bunky vykazujú kardiomyogénny potenciál in vitro, ale podobne ako bunky c-Kit⁺ vykazujú obmedzenú diferenciáciu na funkčné kardiomyocyty in vivo. Chýbajúci ľudský ortológ Sca-1 komplikuje prenos zistení o Sca-1⁺ CPC do klinických aplikácií.

Bunky bočnej populácie identifikované na základe výtoku Hoechstovho farbiva predstavujú tretiu populáciu srdcových progenitorov. Tieto bunky exprimujúce transportér ABCG2 viažuci kazety ATP vykazujú multilineárny potenciál, ale nepokročili do klinického vývoja. Spory týkajúce sa skutočnej regeneračnej kapacity endogénnych CPC sa presunuli na exogénne zdroje buniek a parakrinné mechanizmy.

Bunkové terapie odvodené z kardiosféry

Kardiosféry predstavujú samorozkladajúce sa zhluky buniek odvodených z explantátov srdcového tkaniva. Pri kultivácii vo forme sféroidov tieto bunky exprimujú progenitorové markery a vykazujú multilineárny diferenciačný potenciál. Bunky odvodené z kardiosfér (CDCs) expandované z primárnych kardiosfér postúpili do klinických štúdií pri infarkte myokardu a srdcovom zlyhaní.

Štúdia CADUCEUS preukázala, že infúzia CDC znížila veľkosť jazvy a zvýšila počet životaschopného myokardu u pacientov po infarkte. Funkčné zlepšenie merané ejekčnou frakciou však bolo skromné. Mechanizmus prínosu sa zdá byť primárne parakrinný, pričom faktory vylučované CDC podporujú angiogenézu, znižujú zápal a potenciálne stimulujú endogénnu opravu, a nie priamu výmenu buniek.

Výroba CDC zahŕňa endomyokardiálnu biopsiu, kultiváciu tkanivových explantátov a tvorbu kardiosféry v suspenzii s následnou expanziou ako adherentné CDC. Tento proces umožňuje autológnu prípravu buniek z biopsie pacienta, hoci časové lehoty výroby a variabilita predstavujú výzvy pre akútne aplikácie.

Kardiomyocyty odvodené z indukovaných pluripotentných kmeňových buniek

Indukované pluripotentné kmeňové bunky (iPSC) diferencované na kardiomyocyty (iPSC-CM) ponúkajú škálovateľný, definovaný zdroj buniek na regeneráciu srdca. Riadené diferenciačné protokoly využívajúce moduláciu Wnt dráhy účinne vytvárajú bijúce kardiomyocyty z iPSC. Tieto bunky exprimujú srdcové markery a vykazujú funkčné vlastnosti vrátane manipulácie s vápnikom a kontraktility.

transplantácia iPSC-CM na zvieracích modeloch preukazuje prihojenie a čiastočnú elektrickú integráciu s myokardom hostiteľa. Avšak neúplné dozrievanie iPSC-CM v porovnaní s dospelými kardiomyocytmi vytvára riziko arytmie vyplývajúce z automatizácie a heterogenity vedenia. Stratégie na zlepšenie dozrievania iPSC-CM a elektrickej integrácie zostávajú aktívnymi oblasťami výskumu.

Alogénne produkty iPSC-CM od HLA-homozygotných darcov by mohli poskytnúť hotové bunkové terapie, ktoré by sa vyhli výrobe špecifickej pre pacienta. V Japonsku a ďalších krajinách prebiehajú klinické skúšky hodnotiace bezpečnosť a účinnosť iPSC-CM pri srdcovom zlyhávaní, ktoré predstavujú hranicu liečby pluripotentných kmeňových buniek srdca.

Aplikácie mezenchýmových kmeňových buniek v srdci

Mezenchýmové kmeňové bunky vykazujú kardioprotektívne účinky predovšetkým prostredníctvom parakrinných mechanizmov, a nie diferenciáciou kardiomyocytov. Faktory vylučované MSC vrátane VEGF, IGF-1 a HGF podporujú angiogenézu a prežívanie buniek v ischemickom myokarde. Protizápalové cytokíny znižujú škodlivý zápal po infarkte.

Ľudské mezenchýmové kmeňové bunky - kostná dreň (HMSC-BM ) predstavujú štandardný zdroj MSC pre výskumné aplikácie v oblasti srdca. Klinické štúdie využívajúce MSC z kostnej drene na liečbu infarktu myokardu ukazujú mierny prínos s vynikajúcim bezpečnostným profilom. Ľudské mezenchýmové kmeňové bunky - tukové tkanivo ponúkajú alternatívny zdroj s potenciálne lepšími parakrinnými vlastnosťami pre srdcové aplikácie.

Kardiálna diferenciácia MSC zostáva obmedzená napriek in vitro správam o kardiomyogénnom potenciáli. Terapeutický prínos MSC v kardiologických aplikáciách vyplýva prevažne z parakrinných účinkov, a nie z náhrady buniek. Toto mechanistické chápanie presunulo pozornosť skôr na optimalizáciu dodávania sekrétov MSC než na zvýšenie diferenciácie.

Parakrinné mechanizmy opravy srdca

Exozómy a mikrovezikuly vylučované kardiálnymi progenitorovými bunkami a MSC sprostredkovávajú parakrinné účinky. Tieto extracelulárne vezikuly obsahujú proteíny, mRNA a mikroRNA, ktoré modulujú funkciu recipientných buniek. Exozómy derivované z CDC replikujú prínosy opravy srdca pozorované pri transplantácii celých buniek, čo naznačuje možnosť bezbuneckej terapie založenej na exozómoch.

Podpora angiogenézy zlepšuje perfúziu ischemického myokardu. VEGF, bFGF a angiopoetínové proteíny vylučované transplantovanými bunkami alebo dodávané prostredníctvom exozómov stimulujú tvorbu nových krvných ciev. Zvýšená vaskularizácia podporuje prežívanie kardiomyocytov a potenciálnu endogénnu regeneráciu.

Antifibrotické účinky znižujú tvorbu jaziev a zachovávajú funkciu srdca. Vylučované faktory inhibujú aktiváciu fibroblastov a ukladanie kolagénu. Tento mechanizmus môže vysvetľovať zlepšenia v štruktúre a funkcii srdca pozorované bez významného prihojenia buniek.

Protokoly kultivácie a expanzie

Izolácia kardiálnych progenitorových buniek zvyčajne využíva enzymatickú disociáciu srdcového tkaniva, po ktorej nasleduje selekcia na základe markerov alebo diferenciálna adhézna kultivácia. Izolácia buniek c-Kit⁺ využíva selekciu magnetickými guličkami, zatiaľ čo formovanie kardiosféry prebieha spontánne za vhodných podmienok suspenznej kultivácie.

DMEM/Ham's F12 médium doplnené rastovými faktormi poskytuje štandardné kultivačné podmienky pre expanziu kardiálnych progenitorových buniek. Špecializované médiá pre kardiálne kmeňové bunky obsahujúce definované faktory optimalizujú expanziu pri zachovaní vlastností progenitorových buniek. Mraziace médium CM-1 umožňuje kryokonzerváciu expandovaných kardiálnych progenitorových buniek.

Kontrola kvality produktov srdcových buniek vyžaduje funkčné hodnotenie nad rámec charakterizácie povrchových markerov. Merania prechodného vápnika, elektrofyziologické záznamy a testy kontraktility potvrdzujú funkciu kardiomyocytov. Overenie buneckej línie a testovanie na mykoplazmu zabezpečujú integritu produktu pre výskumné a klinické aplikácie.

Metódy a načasovanie podania

Intramyokardiálna injekcia zabezpečuje priame dodanie do cieľového tkaniva, ale vyžaduje invazívne chirurgické alebo katétrové postupy. Retencia buniek v mieste injekcie je obmedzená, pričom väčšina buniek sa stratí v priebehu hodín až dní v dôsledku mechanického vyplavenia a smrti buniek v nepriaznivom prostredí infarktu.

Intrakoronárna infúzia ponúka menej invazívne podanie, ale spolieha sa na transendoteliálnu migráciu pre homing myokardu. Táto cesta dosahuje širšiu distribúciu, ale ešte nižšiu retenciu ako priama injekcia. Opakované infúzie môžu kompenzovať slabú počiatočnú retenciu.

Načasovanie dodania buniek ovplyvňuje výsledky. Akútne dodanie bezprostredne po infarkte čelí nepriaznivému zápalovému prostrediu, ale môže poskytnúť maximálnu príležitosť na intervenciu. Oneskorené dodanie po ustúpení akútneho zápalu môže zlepšiť prežívanie buniek, ale môže sa minúť terapeutické okno pre maximálny prínos.

Budúce smerovanie

Priame preprogramovanie srdca premieňa fibroblasty na bunky podobné kardiomyocytom in situ bez transplantácie buniek. Kombinácie transkripčných faktorov (Gata4, Mef2c, Tbx5) alebo malé molekuly indukujú osud kardiomyocytov v srdcových fibroblastoch. Tento prístup sa vyhýba problémom s transplantáciou buniek, ale čelí prekážkam v oblasti účinnosti a bezpečnosti.

Kombinované prístupy integrujúce bunkovú terapiu s biomateriálovými nosnými štruktúrami, rastovými faktormi a elektrickou stimuláciou môžu zlepšiť výsledky opravy srdca. Inžinierske prístupy vytvárajúce srdcové náplasti s organizovanou bunkovou architektúrou a cievnym systémom riešia obmedzenia prístupov založených na injekcii buniek.

Záver

Výskum kardiálnych kmeňových buniek sa vyvinul od počiatočného nadšenia z regenerácie sprostredkovanej endogénnymi progenitorovými bunkami k nuansovanejšiemu chápaniu parakrinných mechanizmov a problémov skutočnej regenerácie srdca. Hoci nahradenie kardiomyocytov zostáva ambicióznym cieľom, súčasné dôkazy podporujú parakrinné výhody z rôznych zdrojov buniek. Kardiomyocyty odvodené z iPSC ponúkajú najsľubnejšiu cestu k funkčnej náhrade buniek, pričom sa čaká na riešenie problémov zrenia a integrácie. Pokračujúci výskum, ktorý posúva dopredu ako prístupy založené na nahradení buniek, tak aj parakrinné prístupy, nakoniec prinesie účinné regeneratívne terapie pre pacientov so srdcovým zlyhaním.