Hematopoietic Stem Cell Expansion: Media Optimization Strategies

Expansion des cellules souches hématopoïétiques : stratégies d’optimisation des milieux de culture

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) possèdent la capacité unique de reconstituer l’ensemble du système sanguin et immunitaire grâce à leur auto-renouvellement et à leur différenciation multilignée. Bien que la greffe de CSH constitue un traitement curatif pour les tumeurs hématologiques et les troubles sanguins génétiques, la disponibilité limitée des donneurs et le nombre restreint de cellules limitent son application clinique. La multiplication ex vivo des CSH offre la possibilité de surmonter ces limites en amplifiant le nombre de cellules souches fonctionnelles à partir d’un matériel de départ limité. Les stratégies d’optimisation des milieux de culture sont essentielles pour obtenir une multiplication cliniquement significative tout en préservant la capacité d’implantation et de reconstitution des CSH.

Points clés à retenir

Publié : 2023 | Dernière révision : mai 2026

Le défi de l’expansion des CSH

Les cellules souches hématopoïétiques assurent la production de sang tout au long de la vie grâce à un équilibre délicat entre auto-renouvellement et différenciation. Les cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT) possèdent la plus grande capacité d’auto-renouvellement et assurent une prise de greffe durable après une greffe. Cependant, les CSH-LT représentent moins de 0,01 % des cellules de la moelle osseuse et sont notoirement difficiles à multiplier sans induire une différenciation qui épuise le réservoir de cellules souches.

Les protocoles d’expansion standard à base de cytokines utilisant le SCF, le TPO et le FLT3L permettent d’obtenir des augmentations modestes (de 2 à 10 fois) du nombre de CSH, mais échouent souvent à multiplier les CSH à long terme définies sur le plan fonctionnel. Au contraire, ces conditions favorisent principalement la multiplication de progéniteurs engagés qui assurent une prise de greffe rapide mais transitoire. L’objectif clinique, qui consiste à obtenir à la fois une récupération hématologique rapide et une reconstitution durable à long terme, nécessite des protocoles de multiplication préservant les propriétés des LT-HSC.

Les mécanismes moléculaires régissant les décisions d’auto-renouvellement ou de différenciation des CSH orientent les stratégies d’optimisation des milieux de culture. Des voies de signalisation, notamment celles de Wnt/β-caténine, de Notch et du récepteur des hydrocarbures aromatiques (AhR), influencent les décisions relatives au destin des CSH. Des petites molécules ciblant ces voies ont permis une expansion révolutionnaire des CSH, impossible à obtenir avec les cytokines seules.

Approches d’expansion à base de cytokines

Le facteur de croissance des cellules souches (SCF/ligand de Kit) constitue la cytokine fondamentale pour la culture des CSH, favorisant leur survie et leur prolifération par l’intermédiaire de la signalisation du récepteur c-Kit. À lui seul, le SCF maintient la viabilité des CSH, mais ne permet qu’une expansion limitée. L’association avec la thrombopoïétine (TPO), qui agit par l’intermédiaire du récepteur MPL, améliore l’expansion en activant des voies de survie complémentaires.

Le ligand FLT3 (FL) favorise la multiplication des progéniteurs multipotents et des précurseurs lymphoïdes précoces lorsqu’il est combiné au SCF et à la TPO. Cette combinaison de trois cytokines (SCF + TPO + FL) constitue un cocktail d’expansion standard permettant d’obtenir une multiplication totale des cellules de 5 à 10 fois en 7 à 14 jours. Cependant, l’expansion fonctionnelle des CSH, telle que mesurée par des tests de repeuplement compétitifs, est plus modeste.

L’IL-3 et l’IL-6 favorisent la prolifération des progéniteurs, mais peuvent accélérer la différenciation et l’épuisement des CSH. Ces cytokines sont exclues de certains protocoles spécialement conçus pour préserver les CSH primitives. À l’inverse, les protocoles privilégiant une expansion rapide du nombre de cellules à des fins cliniques peuvent inclure ces facteurs afin de maximiser le rendement cellulaire total.

Agents d’expansion à petites molécules

Le StemRegenin 1 (SR1), un antagoniste des récepteurs aux hydrocarbures aromatiques, représente une percée dans la technologie d’expansion des CSH. Associé à des cytokines standard, le SR1 permet une multiplication par 50 des cellules CD34+, tout en préservant la fonction des CSH, comme le démontre une prise de greffe supérieure dans les modèles de xénotransplantation. Des essais cliniques utilisant du sang de cordon ombilical multiplié par le SR1 ont démontré la sécurité et l’efficacité de cette approche.

L’UM171, un dérivé de pyrimidoindole identifié par criblage phénotypique, permet une expansion robuste des CSH par un mécanisme distinct de celui du SR1. L’UM171, combiné au SR1, procure une expansion additive ou synergique des CSH, supérieure à celle obtenue avec l’un ou l’autre des composés pris isolément. La cible de l’UM171 fait toujours l’objet d’études, mais elle implique la régulation épigénétique des gènes d’auto-renouvellement des CSH.

Les inhibiteurs d’histone désacétylase, notamment l’acide valproïque et la nicotinamide, favorisent la multiplication des CSH en modulant l’accessibilité de la chromatine au niveau des gènes de l’auto-renouvellement. Ces modulateurs épigénétiques, combinés à des cytokines, préservent les phénotypes primitifs des CSH pendant la culture de multiplication. La transposition clinique nécessite une optimisation minutieuse afin de trouver un équilibre entre la multiplication et les considérations de sécurité.

Développement de milieux définis sans sérum

La multiplication des CSH de qualité clinique nécessite des milieux définis sans sérum, éliminant ainsi la variabilité entre les lots et les risques de contamination xénogénique. Les formulations de milieux définis remplacent le sérum par des combinaisons spécifiques d’albumine, de lipides, d’insuline, de transferrine et d’autres facteurs favorisant la survie et la prolifération des CSH. Ces milieux permettent une fabrication normalisée adaptée à l’approbation réglementaire.

Le choix du milieu de base influe sur les résultats de l’expansion des CSH. L’IMDM (milieu de Dulbecco modifié par Iscove) et le StemSpan constituent des milieux de base couramment utilisés pour la culture des CSH. L’ajout d’albumine sérique bovine (BSA) ou d’albumine sérique humaine (HSA) apporte les lipides essentiels et maintient l’osmolarité. Les cytokines recombinantes remplacent les facteurs de croissance dérivés du sérum.

Le milieu RPMI 1640 constitue un milieu de base pour les applications de culture de cellules hématopoïétiques. Des formulations spécialisées, optimisées pour la multiplication des CSH, sont disponibles dans le commerce. Le milieu de congélation CM-1 permet la cryoconservation des produits dérivés de CSH multipliées, tandis que les milieux de cryoconservation sans sérum permettent la mise en banque de qualité clinique.

Publié : 2023 | Dernière révision : mai 2026

Optimisation des bioréacteurs et des systèmes de culture

Les systèmes de culture en fed-batch avec remplacement périodique du milieu maintiennent des concentrations optimales en nutriments tout au long de la multiplication cellulaire. Les concentrations en cytokines et en petites molécules diminuent en raison de la consommation et de la dégradation cellulaires; l’alimentation en fed-batch permet de reconstituer ces facteurs. Cette approche permet d’obtenir une multiplication cellulaire supérieure à celle obtenue avec une culture statique par lots sans échange de milieu.

Les bioréacteurs à perfusion fournissent en continu du milieu frais tout en éliminant les déchets métaboliques. Cette approche de culture continue maintient des conditions d’équilibre optimales pour l’auto-renouvellement des CSH. Les systèmes de perfusion automatisés permettent une fabrication clinique à grande échelle avec une qualité de produit constante.

La culture hypoxique (1 à 5 % d’O₂) reproduit mieux l’environnement de la niche médullaire où résident les CSH. Les facteurs inductibles par l’hypoxie, activés en présence de faibles concentrations d’oxygène, favorisent la quiescence et l’auto-renouvellement des CSH. Les niveaux physiologiques d’oxygène peuvent améliorer le maintien des CSH pendant l’expansion par rapport à une culture atmosphérique standard.

Soutien par la co-culture stromale

Les cellules stromales de la moelle osseuse fournissent des facteurs de niche favorisant le maintien et l’expansion des CSH. La co-culture avec des lignées cellulaires stromales immortalisées (OP9, MS-5) ou des cellules stromales mésenchymateuses primaires améliore l’expansion des CSH par rapport à des conditions où seules des cytokines sont présentes. Les cellules stromales sécrètent des cytokines supplémentaires, présentent des signaux liés à la membrane et produisent une matrice extracellulaire qui soutient la fonction des CSH.

Les cellules souches mésenchymateuses humaines – moelle osseuse fournissent un soutien stromal humain pour les études sur l’expansion des CSH. Ces cellules peuvent être irradiées pour prévenir la prolifération excessive tout en conservant leur capacité de soutien. D’autres sources de CSM, notamment les CSM dérivées du tissu adipeux, offrent des options de soutien stromal accessibles.

L’expansion sans cellules nourricières, à l’aide d’un milieu conditionné par le stroma ou de combinaisons définies de facteurs de niche, simplifie la fabrication et permet une production de qualité clinique. Les ligands Notch (protéines de type Delta), présentés à la surface des cellules ou sous forme de facteurs solubles, reproduisent partiellement le soutien stromal. Ces approches s’orientent vers des protocoles d’expansion des CSH entièrement définis et adaptables à grande échelle.

Évaluation fonctionnelle des CSH multipliées

L’analyse phénotypique à l’aide de marqueurs de surface permet une évaluation rapide de l’expansion des CSH, mais peut ne pas refléter l’activité fonctionnelle des cellules souches. Les cellules CD34⁺CD38⁻CD90⁺CD45RA⁻ représentent une population de CSH humaines définie sur le plan phénotypique, mais l’expression des marqueurs peut changer au cours de la culture sans que cela s’accompagne de changements fonctionnels correspondants.

Les tests d’unités formant colonie (UFC) quantifient la teneur en progéniteurs au sein des populations multipliées. Une augmentation du nombre d’UFC confirme la multiplication des cellules hématopoïétiques fonctionnelles, mais ne mesure pas spécifiquement les CSH, car les progéniteurs différenciés forment également des colonies. Les tests d’UFC fournissent des mesures intermédiaires utiles lors de l’optimisation des protocoles.

La xénotransplantation chez des souris immunodéficientes constitue la référence absolue pour l’évaluation fonctionnelle des CSH. La prise de greffe des cellules humaines CD45⁺ 12 à 16 semaines après la greffe reflète l’activité à long terme des CSH en matière de repeuplement. Le repeuplement compétitif, qui compare les cellules multipliées à celles non multipliées, permet de quantifier le facteur de multiplication des CSH fonctionnelles. Les greffes en série confirment le maintien de la capacité d’auto-renouvellement.

Contrôle de la qualité et considérations réglementaires

L’authentification des lignées cellulaires et le suivi des donneurs garantissent l’identité du produit tout au long du processus de fabrication. Les tests de dépistage des mycoplasmes préviennent toute contamination susceptible de compromettre les produits cliniques. Les tests de stérilité, la quantification des endotoxines et l’évaluation de la viabilité constituent des critères de mise en circulation essentiels.

La surveillance de la stabilité génétique garantit que les CSH multipliées conservent un caryotype normal sans transformation. Une culture prolongée augmente le risque d’altérations génétiques; les protocoles de multiplication établissent un équilibre entre un rendement maximal et les risques liés à la stabilité génétique. Une multiplication à court terme (7 à 14 jours) minimise ce risque tout en permettant une multiplication cellulaire cliniquement significative.

Conclusion

L’optimisation des milieux de multiplication des CSH continue de progresser vers une multiplication des cellules souches cliniquement significative. Les combinaisons de cocktails de cytokines optimisés et d’agents favorisant l’auto-renouvellement à base de petites molécules permettent d’atteindre des niveaux de multiplication ouvrant la voie à de nouvelles applications cliniques. Des formulations de milieux définis sans sérum et des systèmes de bioréacteurs sophistiqués soutiennent la fabrication de qualité clinique. La validation fonctionnelle par xénotransplantation garantit que les produits expansés conservent la capacité de prise de greffe et de reconstitution essentielle à l’efficacité thérapeutique.