Hematopoietic Stem Cell Expansion: Media Optimization Strategies

造血幹細胞擴增：培養基優化策略

造血幹細胞（HSCs）具備透過自我更新與多系分化來重建整個血液及免疫系統的獨特能力。儘管造血幹細胞移植是治療血液惡性腫瘤及遺傳性血液疾病的根治性療法，但捐贈者數量有限及細胞數量不足，卻限制了其臨床應用。 體外造血幹細胞擴增技術，透過從有限的起始材料中放大功能性幹細胞，有望克服這些限制。培養基優化策略對於在維持造血幹細胞植入與重建能力的同时，實現具臨床意義的擴增至關重要。

重點摘要

發佈日期：2023年 | 最後審閱日期：2026年5月

造血幹細胞擴增的挑戰

造血幹細胞透過自我更新與分化的精妙平衡，終生維持造血功能。 長期造血幹細胞（LT-HSCs）具備最強大的自我更新能力，並能在移植後提供持久的植入效果。然而，LT-HSCs 僅佔骨髓細胞的不到 0.01%，且眾所周知，若不誘發分化（這會耗盡幹細胞庫），則極難擴增這些細胞。

採用 SCF、TPO 和 FLT3L 的標準細胞因子擴增方案，雖能使造血幹細胞數量溫和增加（2 至 10 倍），但往往無法擴增功能上定義的長期造血幹細胞。相反地，這些條件主要擴增的是已分化定型的前體細胞，雖能提供快速但短暫的植入效果。 若要達成「快速血液學恢復」與「持久長期重建」的雙重臨床目標，則需採用能保留 LT-HSC 特性的擴增方案。

控制造血幹細胞（HSC）自更新與分化決策的分子機制，是指導培養基優化策略的關鍵。包括 Wnt/β-catenin、Notch 及芳香烴受體（AhR）訊號傳導在內的路徑，皆會影響 HSC 的命運決策。針對這些路徑的小分子藥物，已實現了單靠細胞因子無法達成的突破性 HSC 擴增效果。

基於細胞因子的擴增方法

幹細胞因子（SCF／Kit配體）是造血幹細胞培養的基礎細胞因子，透過c-Kit受體訊號傳導促進細胞存活與增殖。 單獨使用 SCF 雖能維持 HSC 的存活能力，但擴增效果有限。與透過 MPL 受體傳遞訊號的血小板生成素（TPO）聯合使用，可透過激活互補的存活途徑來增強擴增效果。

FLT3 配體 (FL) 與 SCF 和 TPO 聯合使用時，可擴增多能前體細胞和早期淋巴樣前體細胞。這種三種細胞因子的組合（SCF+TPO+FL）代表了一種標準的擴增混合物，可在 7-14 天內實現 5-10 倍的總細胞擴增。 然而，以競爭性再定植試驗所測量的功能性造血幹細胞（HSC）擴增效果則較為有限。

IL-3 和 IL-6 雖能促進前體細胞增殖，但可能加速造血幹細胞的分化與耗竭。在某些專為維持原始造血幹細胞而設計的方案中，會排除這些細胞因子。相反地，優先考量臨床應用所需快速增加細胞數量的方案，則可能納入這些因子以最大化總細胞產量。

小分子擴增增強劑

StemRegenin 1（SR1）作為一種芳香烴受體拮抗劑，代表了造血幹細胞擴增技術的一項突破。SR1 結合標準細胞因子，可使 CD34+ 細胞擴增 50 倍，同時維持造血幹細胞功能，這點已透過異種移植模型中優異的植入效果所證實。 使用 SR1 擴增之臍帶血進行的臨床試驗已證實其安全性和有效性。

UM171 是一種透過表型篩選鑑定出的嘧啶吲哚衍生物，其擴增造血幹細胞的機制與 SR1 不同，但效果同樣顯著。UM171 與 SR1 聯合使用時，可產生加成或協同作用，使造血幹細胞的擴增效果超越單一化合物。 UM171 的作用靶點仍在研究中，但涉及造血幹細胞自我更新基因的表觀遺傳調控。

包括丙戊酸和菸醯胺在內的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可透過調節自我更新基因的染色質可及性來增強造血幹細胞的擴增。這些表觀遺傳調控劑與細胞因子結合，可在擴增培養期間維持原始造血幹細胞的表型。臨床應用需經過謹慎的優化，以在擴增效果與安全考量之間取得平衡。

無血清定義培養基的開發

臨床級造血幹細胞擴增需要使用無血清定義培養基，以消除批次變異性及異種污染風險。定義培養基配方以白蛋白、脂質、胰島素、轉鐵蛋白及其他支持造血幹細胞存活與增殖因子的特定組合，取代血清成分。此類培養基可實現符合監管批准要求的標準化生產。

基礎培養基的選擇會影響造血幹細胞擴增的結果。 IMDM（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）和StemSpan是造血幹細胞培養中常用的基礎培養基。補充牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白（HSA）可提供必需的脂質並維持滲透壓。重組細胞因子則取代了源自血清的生長因子。

RPMI 1640 培養基為造血細胞培養應用提供基礎培養基。市面上亦有針對造血幹細胞擴增而優化調配的專用配方。CM-1 冷凍培養基可支援擴增後造血幹細胞產品的冷凍保存，而無血清冷凍保存培養基則可實現臨床級別的細胞庫儲存。

發佈日期：2023年 | 最後審閱日期：2026年5月

生物反應器與培養系統優化

採用週期性培養基更換的加料分批培養系統，能在整個擴增過程中維持最佳的營養濃度。細胞因子和小分子濃度會因細胞消耗與降解而下降；加料分批培養中的補料過程則可補充這些因子。相較於不更換培養基的靜態分批培養，此方法能實現更優異的擴增效果。

灌流生物反應器在持續供應新鮮培養基的同時，亦能移除代謝廢物。此連續培養方法可維持穩態條件，此環境最適於造血幹細胞（HSC）的自我更新。自動化灌流系統能實現大規模臨床生產，並確保產品品質的一致性。

缺氧培養（1-5% O₂）更能模擬造血幹細胞所處的骨髓微環境。在低氧條件下活化的缺氧誘導因子，可促進造血幹細胞進入靜止狀態並進行自我更新。相較於標準大氣壓培養，生理性氧濃度有助於在擴增過程中維持造血幹細胞的活性。

基質共培養支持

骨髓基質細胞提供支持造血幹細胞維持與擴增的微環境因子。與不朽化基質細胞系（OP9、MS-5）或原代間質基質細胞進行共培養，相較於僅使用細胞因子的條件，能增強造血幹細胞的擴增效果。 基質細胞會分泌額外的細胞因子、呈現膜結合型訊號，並產生支持造血幹細胞功能的細胞外基質。

「人類間質幹細胞 - 骨髓」為造血幹細胞擴增研究提供人類基質支持。這些細胞可經輻射處理以防止過度增殖，同時維持其支持能力。其他間質幹細胞來源（包括脂肪來源的間質幹細胞）亦提供可行的基質支持選項。

利用基質調製培養基或特定微環境因子組合進行無餵養細胞擴增，可簡化製程並實現臨床級別的生產。表觀於細胞表面或以可溶性因子形式存在的 Notch 配體（Delta 樣蛋白），能部分重現基質支持作用。這些方法正朝著完全定義化且可擴展的造血幹細胞擴增方案邁進。

擴增後造血幹細胞的功能評估

利用表面標記進行的表型分析，可快速評估造血幹細胞的擴增狀況，但未必能反映幹細胞的功能活性。CD34⁺CD38⁻CD90⁺CD45RA⁻ 細胞代表了一群表型明確的人類造血幹細胞，但在培養過程中，標記物的表達可能發生變化，而功能卻未必隨之改變。

集落形成單位（CFU）檢測可量化擴增群體中的前體細胞含量。CFU 數量的增加雖可證實功能性造血細胞已成功擴增，但無法特異性地測量造血幹細胞，因為已分化前體細胞同樣會形成集落。在優化擴增方案的過程中，CFU 檢測可提供有用的中間指標。

將細胞移植至免疫缺陷小鼠體內，是評估功能性造血幹細胞的黃金標準。 移植後 12–16 週人類 CD45⁺ 細胞的植入情況，反映了長期重建能力的造血幹細胞活性。透過比較擴增與未擴增細胞的競爭性重建能力，可量化功能性造血幹細胞的擴增倍數。連續移植可確認自我更新能力的維持狀況。

品質控制與法規考量

細胞系認證與捐贈者追蹤，可確保產品在整個製造過程中保持同一性。支原體檢測可防止可能危及臨床產品的污染。無菌檢測、內毒素定量及存活率評估，構成必要的放行標準。

基因穩定性監測可確保擴增後的造血幹細胞維持正常核型，且未發生轉化。延長培養時間會增加基因變異的風險；擴增方案需在最大化產量與基因穩定性風險之間取得平衡。短期擴增（7-14 天）可在實現具臨床意義的細胞增殖的同時，將此風險降至最低。

結論

造血幹細胞擴增培養基的優化持續推進，以實現具有臨床意義的幹細胞擴增。將優化的細胞因子混合物與小分子自我更新增強劑相結合，可達到足以支援新臨床應用的擴增水平。定義明確的無血清培養基配方與先進的生物反應器系統，共同支持臨床級別的生產。 透過異種移植進行的功能驗證，可確保擴增後的產品維持對治療功效至關重要的植入與重建能力。