Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

循環腫瘤細胞：分離技術與培養方案

循環腫瘤細胞（CTCs）是指從原發性腫瘤或轉移部位脫落，進入血液循環的稀有癌細胞。儘管其數量極少——在數十億個正常血細胞中，每毫升血液通常僅含不到 10 個 CTCs——但這些細胞對於理解腫瘤生物學、轉移機制及治療反應，提供了極其寶貴的見解。 隨著 CTC 分離技術與培養方案的進步，研究人員現已能夠捕獲、計數並鑑定這些細胞，應用於從液體活檢診斷到體外藥物敏感性測試等精準腫瘤學領域。

重點摘要

• CTC 的出現頻率極低，因此需要高度敏感且特異性的富集技術
• 分離方法利用物理特性（大小、密度）或生物標記（EpCAM）來捕獲 CTC
• 成功的 CTC 培養需具備特殊條件，以應對細胞脫附抵抗及增殖方面的挑戰
• 源自 CTC 的細胞系和異種移植模型，為藥物敏感性測試及機制研究提供了平台
• 對 CTC 進行單細胞分析，可揭示腫瘤在治療壓力下的異質性與演化過程

發佈日期：2023年 | 最後審閱日期：2026年5月

循環腫瘤細胞（CTC）稀有性帶來的挑戰

循環腫瘤細胞在周邊血液中屬於極其稀少的細胞群，通常每 10 毫升血液中僅有 1 至 100 個，而這 10 毫升血液中約含有 500 億個紅血球和 5,000 萬個白血球。 這種稀有性——約每百萬至一千萬個有核血細胞中僅含一個 CTC——要求必須採用高度敏感且特異的富集技術，才能在剔除大量正常血細胞背景的同時，成功回收這些稀有事件。

CTC 的豐度與疾病分期相關，轉移性患者的 CTC 數量通常多於局部病變患者。 然而，即使在晚期癌症中，CTC 仍屬罕見，且部分患者儘管存在廣泛的轉移性病變，其 CTC 仍無法被檢測到。這種變異性反映了腫瘤細胞侵入血管、在循環系統中存活以及向遠端部位外滲等生物學過程的複雜性。

CTC 作為預後與預測生物標記物的臨床意義，已在多種癌症類型中獲得確立。美國食品藥物管理局（FDA）核准 CellSearch 系統用於轉移性乳癌、前列腺癌及大腸直腸癌的 CTC 計數，進一步驗證了 CTC 作為臨床實用生物標記物的價值。相關研究持續將應用範圍從計數拓展至分子特徵分析，從而推動精準腫瘤學策略的發展。

免疫磁性分離法

CellSearch 系統是經 FDA 核准的 CTC 分離平台中的黃金標準。此方法利用與抗 EpCAM（上皮細胞黏附分子）抗體結合的免疫磁珠，來捕獲源自上皮組織的腫瘤細胞。 經磁分離後，透過細胞角蛋白和 DAPI 的陽性染色來識別 CTC，並利用白細胞標記物 CD45 的陰性染色排除混入的白血球。

基於 EpCAM 的捕獲技術能有效富集來自維持上皮表型的癌瘤之 CTC，但可能漏檢那些已發生上皮-間質轉化（EMT）並下調上皮標記物的 CTC。與 EMT 相關的 CTC 亞群可能具有增強的轉移潛能，因此檢測它們在臨床上至關重要。 針對間質標記物所使用的替代性或附加性捕獲抗體，可擴大對表型多樣化 CTC 的檢測範圍。

負向耗竭法是透過去除正常血細胞，而非正向篩選 CTC。基於 CD45 的耗竭法可去除白血球，從而能獨立於上皮標記物的表達而回收 CTC。此方法可捕獲表型多樣化的 CTC 群體（包括 EMT 細胞），但其純度低於正向篩選方法。

基於粒徑與微流體的分離

基於粒徑的分離技術利用了大多數 CTC（15-25 μm）的直徑較白血球（7-15 μm）更大的特性。 透過具有特定孔徑（通常為 8 μm）的膜進行過濾，可保留 CTC 並讓較小的血細胞通過。此無標記方法能捕獲任何表面標記表達狀態的 CTC，但可能遺漏體積較小或具有變形能力、能穿過孔隙的 CTC。

微流體裝置透過整合物理與生物分離原理，實現精密的 CTC 分離。CTC-iChip 結合了基於尺寸的確定性側向位移富集技術，以及透過免疫磁力法去除白血球。這種負向篩選方法可在無需抗體標記的情況下回收存活的 CTC，避免抗體標記可能對後續培養或分析造成的干擾。

在微流體平台上，透過在晶片表面整合抗 EpCAM 抗體，可在受控的流體條件下捕獲 CTC。這些裝置不僅能達到高捕獲效率，還能與下游分析整合，包括晶片上免疫染色或釋放細胞進行培養。並行化的微流體設計則可提升臨床應用的處理量。

CTC 培養方案

CTC 培養除了其稀有性之外，還面臨著重大的挑戰。 循環腫瘤細胞必須在脫離原發腫瘤基質、侵入血管、承受循環剪切應力以及抵禦免疫攻擊等過程中存活下來——這使得具備獨特生存特性的細胞得以被篩選出來。這些倖存細胞在針對成熟細胞系優化的標準培養條件下，往往處於靜止狀態或容易發生凋亡。

超低附著培養條件可防止「脫附性凋亡」（anoikis），從而促進 CTC 的存活。 在含有 EGF、FGF 和胰島素的幹細胞培養基中進行懸浮培養，既能促進 CTC 增殖，又能維持其腫瘤起始能力。在此條件下進行三維球體培養，可富集具有幹細胞樣特性的細胞。

與大氣氧濃度相比，缺氧培養（1-5% O₂）能提升 CTC 的存活率與增殖能力。缺氧環境可維持幹細胞特性，並減輕可能限制 CTC 擴增的氧化壓力。將低氧環境與特殊培養基及生長因子結合，可提供有利於 CTC 擴增的條件。

源自循環腫瘤細胞（CTC）的細胞系與異種移植模型

成功建立源自循環腫瘤細胞（CTC）的永久性細胞系仍具挑戰性，即使來自轉移性患者，成功率通常也不超過 20%。一旦成功建立，這些細胞系便能提供可重複使用的模型，以代表轉移性細胞群。源自 CTC 的細胞系展現出與原發性腫瘤衍生細胞系不同的特性，反映出在轉移擴散過程中的自然選擇。

透過將患者的循環腫瘤細胞（CTC）注射至免疫缺陷小鼠體內所建立的CTC衍生異種移植模型（CDX），可作為藥物測試與轉移研究的體內模型。 CDX的建立率因癌症類型及CTC豐度而異，但已成功應用於多種腫瘤類型。這些模型能維持患者的腫瘤特徵，並使在CTC數量有限的情況下無法進行的治療研究成為可能。

在癌症比較研究方面，已建立的細胞系提供了特徵明確的模型。A549 細胞代表肺腺癌，可用於與肺癌 CTC 進行比較；MCF-7 細胞與乳癌 CTC 則可進行乳癌模型的驗證；HCT116 細胞則提供大腸直腸癌的參考模型。

CTC 的單細胞分析

單細胞分子定型分析透過分析單一細胞而非混合細胞群，克服了 CTC 異質性帶來的挑戰。單細胞 RNA 定序揭示了 CTC 群體內的轉錄組多樣性，並能識別出具有明顯轉移性或治療抗藥性特徵的亞群。這種異質性既反映了腫瘤的內在多樣性，也反映了其對循環環境的適應。

單細胞DNA定序可識別個別CTC中的突變與拷貝數變異。透過與原發性及轉移性腫瘤樣本進行比對，可追蹤疾病進展與治療過程中的克隆演化。CTC可能在臨床檢測到治療失敗之前便已攜帶抗藥性突變，從而使早期介入成為可能。

利用免疫螢光或質譜流式細胞術進行蛋白質層級的單細胞分析，可闡明 CTC 的表型特徵，包括上皮-間質轉化（EMT）狀態、增殖標記物以及藥物靶點的表達。這些資訊可指導治療方案的選擇，並在單細胞層級監測治療反應。

臨床應用與未來發展方向

CTC 計數可為多種癌症類型提供預後資訊。較高的 CTC 計數與較差的預後相關，而治療期間 CTC 數量的變化則可預測治療反應。透過連續 CTC 監測，可藉由微創抽血進行疾病狀態的即時評估。

針對擴增的 CTC 或 CTC 衍生物模型進行藥物敏感性檢測，有助於選擇個人化治療方案。將患者的 CTC 體外暴露於候選療法中，可在臨床給藥前識別有效治療方案。這種功能性精準醫學方法，可與基因組分析相輔相成，共同提供治療指引。

細胞系認證透過與患者腫瘤樣本進行比對，確認源自 CTC 的細胞系身分。支原體檢測確保在 CTC 擴增過程中培養的完整性。CM-1 冷凍培養基可將源自 CTC 的細胞儲存起來，以供縱向研究之用。

結論

循環腫瘤細胞的分離與培養技術已取得顯著進展，使研究人員得以接觸這類稀有但具臨床重要性的細胞群。 多種分離平台可應對 CTC 的稀有性與表型多樣性，而專用的培養條件則能支持 CTC 的擴增，以進行功能性研究。單細胞分析揭示了 CTC 的異質性及其在治療過程中的演變。隨著技術持續進步，CTC 將在精準腫瘤學中扮演日益重要的角色，從預後計數到功能性藥物敏感性檢測，進而指導個人化治療方案的選擇。