Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Циркулюючі пухлинні клітини: Методи виділення та протоколи культивування

Циркулюючі пухлинні клітини (ЦПК) - це рідкісні ракові клітини, що потрапляють з первинних пухлин або метастазів у кровотік. Незважаючи на їх дефіцит - зазвичай менше 10 ЦПК на мілілітр крові серед мільярдів нормальних клітин крові - ці клітини дають безцінну інформацію про біологію пухлини, механізми метастазування та реакцію на лікування. Досягнення в технологіях виділення ЦТК і протоколах культивування тепер дозволяють дослідникам захоплювати, перераховувати і характеризувати ці клітини для прецизійних онкологічних застосувань, починаючи від діагностики рідинної біопсії і закінчуючи тестуванням чутливості до лікарських препаратів ex vivo.

Основні висновки

• ЦТК відбуваються на надзвичайно низьких частотах, що вимагає високочутливих і специфічних технологій збагачення
• Методи ізоляції використовують фізичні властивості (розмір, щільність) або біологічні маркери (EpCAM) для захоплення ЦТК
• Успішне культивування ЦТК вимагає спеціальних умов, що забезпечують стійкість до аноікісів та проліферацію
• Клітинні лінії та ксенотрансплантати, отримані з ЦТК, забезпечують платформи для тестування чутливості до лікарських засобів та механістичних досліджень
• Аналіз одноклітинних ЦТК виявляє гетерогенність пухлин та їх еволюцію під впливом лікування

Проблема рідкісності ЦТК

Циркулюючі пухлинні клітини є надзвичайно рідкісною популяцією в периферичній крові, яка зазвичай зустрічається з частотою 1-100 клітин на 10 мл крові, що містить приблизно 50 мільярдів еритроцитів і 50 мільйонів лейкоцитів. Ця рідкісна популяція - приблизно одна CTC на мільйон-десять мільйонів ядровмісних клітин крові - вимагає високочутливих і специфічних технологій збагачення, здатних відновлювати рідкісні події, не виснажуючи при цьому величезний фон нормальних кров'яних клітин.

Кількість ПСК корелює зі стадією захворювання, причому метастатичні пацієнти зазвичай мають більше ПСК, ніж пацієнти з локалізованою хворобою. Однак навіть на пізніх стадіях раку ЦТК залишаються рідкісними, а деякі пацієнти мають невизначувані ЦТК, незважаючи на поширені метастатичні захворювання. Така варіабельність відображає складну біологію інтравазації пухлинних клітин, виживання в кровообігу та екстравазації у віддалені ділянки.

Клінічна значущість ЦТК як прогностичних біомаркерів була встановлена для багатьох типів раку. Дозвіл FDA на використання системи CellSearch для підрахунку ЦТК при метастатичному раку молочної залози, передміхурової залози та товстої кишки підтвердив, що ЦТК є клінічно корисними біомаркерами. Дослідження продовжують розширювати сферу застосування від підрахунку до молекулярної характеризації, що уможливлює застосування прецизійних підходів в онкології.

Методи імуномагнітної ізоляції

Система CellSearch є золотим стандартом, схваленим FDA для виділення ЦТК. Цей метод використовує імуномагнітні кульки, кон'юговані з антитілами до анти-EpCAM (молекула адгезії епітеліальних клітин), для захоплення епітеліальних пухлинних клітин. Після магнітної сепарації ЦТК ідентифікуються шляхом позитивного забарвлення на цитокератини і DAPI та негативного забарвлення на лейкоцитарний маркер CD45, що виключає забруднюючі лейкоцити.

Захоплення на основі EpCAM ефективно збагачує ЦТК з карцином, що зберігають епітеліальні фенотипи, але може пропустити ЦТК, які пройшли епітеліально-мезенхімальний перехід (ЕМТ) і втратили регуляцію епітеліальних маркерів. ЕМТ-асоційовані субпопуляції РМЗ можуть мати підвищений метастатичний потенціал, що робить їх виявлення клінічно важливим. Альтернативні або додаткові антитіла захоплення, націлені на мезенхімальні маркери, розширюють можливості виявлення фенотипічно різноманітних ЦТК.

Підходи негативного виснаження видаляють нормальні клітини крові, а не позитивно селекціонують ХТК. Виснаження на основі CD45 видаляє лейкоцити, що дозволяє відновити ЦТК незалежно від експресії епітеліальних маркерів. Цей підхід захоплює фенотипічно різноманітні популяції ПСК, включаючи клітини ЕМТ, але забезпечує нижчу чистоту, ніж методи позитивної селекції.

Ізоляція за розміром та мікрофлюїдна ізоляція

Розділення за розміром використовує більший діаметр більшості ЦТК (15-25 мкм) порівняно з лейкоцитами (7-15 мкм). Фільтрація через мембрани з визначеними розмірами пор (зазвичай 8 мкм) затримує ЦТК, пропускаючи при цьому менші клітини крові. Цей підхід без мітки захоплює ЦТК незалежно від експресії поверхневих маркерів, але може втрачати менші за розміром ЦТК або ЦТК, які здатні деформуватися, що дозволяє їм проходити через пори.

Мікрофлюїдні пристрої дозволяють проводити складне виділення ЦТК завдяки інтегрованим фізичним і біологічним принципам розділення. CTC-iChip поєднує детерміноване бічне зміщення для збагачення на основі розміру з імуномагнітним виснаженням лейкоцитів. Цей підхід негативної селекції відновлює життєздатні ЦТК без маркування антитілами, яке може перешкоджати подальшому культивуванню або аналізу.

Мікрофлюїдні платформи, що містять антитіла проти EpCAM на поверхні чипів, захоплюють ЦТК в умовах контрольованого потоку. Ці пристрої досягають високої ефективності захоплення, забезпечуючи при цьому інтеграцію з подальшим аналізом, включаючи імунофарбування на чипі або виділення клітин для культивування. Розпаралелені мікрофлюїдні конструкції збільшують пропускну здатність для клінічних застосувань.

Протоколи культивування ЦТК

Культивування ЦТК пов'язане зі значними труднощами, які виходять за рамки їхньої рідкісності. Циркулюючі пухлинні клітини повинні пережити відшарування від первинного пухлинного матриксу, інтравазацію, циркуляторний зсувний стрес і імунну атаку - відбір клітин з виразними властивостями виживання. Ці клітини, що вижили, часто залишаються в стані спокою або схильні до апоптозу в стандартних умовах культивування, оптимізованих для вже існуючих клітинних ліній.

Умови культивування з наднизьким рівнем прикріплення сприяють виживанню ПТК, запобігаючи аноікісу (апоптозу, спричиненому відшаруванням). Суспензійне культивування в середовищі стовбурових клітин, що містить EGF, FGF та інсулін, підтримує проліферацію ПТК, зберігаючи при цьому пухлиноініціюючі властивості. Тривимірна культура сфероїдів в цих умовах збагачується клітинами зі стовбуровими властивостями.

Гіпоксична культура (1-5% O₂) покращує виживання та проліферацію РПК порівняно з атмосферним киснем. Гіпоксія підтримує властивості стовбурових клітин і зменшує окислювальний стрес, який може обмежувати експансію ПСК. Поєднання низького вмісту кисню зі спеціалізованими середовищами та факторами росту створює умови, сприятливі для росту ХТК.

Клітинні лінії та ксенотрансплантати, отримані з ЦТК

Успішне створення постійних клітинних ліній, отриманих з ЦТК, залишається складним завданням, оскільки рівень успіху зазвичай не перевищує 20% навіть у пацієнтів з метастазами. У разі досягнення успіху ці клітинні лінії забезпечують поновлювані моделі, що представляють популяцію метастатичних клітин. Клітинні лінії, отримані з ПТК, демонструють властивості, відмінні від ліній, отриманих з первинної пухлини, що відображає селекцію під час метастатичного поширення.

Ксенотрансплантати, отримані з ПСК (CDX), що утворюються при введенні пацієнтських ПСК імунодефіцитним мишам, є моделями in vivo для тестування ліків і вивчення метастазів. Частота приживлення ксенотрансплантатів залежить від типу раку та чисельності ХТК, але вона була досягнута для багатьох типів пухлин. Ці моделі зберігають характеристики пухлини пацієнта і дозволяють проводити терапевтичні дослідження, неможливі при обмеженій кількості CTC.

Для порівняльних досліджень раку відомі клітинні лінії забезпечують добре охарактеризовані моделі. Клітини A549 представляють аденокарциному легень для порівняння з ПТК раку легень. Клітини MCF-7 та ПТК раку молочної залози дозволяють валідацію моделі раку молочної залози. Клітини HCT116 забезпечують референтні моделі колоректального раку.

Аналіз одноклітинних ЦТК

Молекулярне профілювання одноклітинних клітин долає проблеми гетерогенності ЦТК, аналізуючи окремі клітини, а не об'єднані популяції. Секвенування РНК одноклітинних клітин виявляє транскриптомну різноманітність у популяціях РТК, ідентифікуючи субпопуляції з відмінними метастатичними властивостями або резистентністю до лікування. Ця гетерогенність відображає як внутрішню різноманітність пухлини, так і адаптацію до середовища кровообігу.

Секвенування ДНК одноклітинних пухлин дозволяє виявити мутації та зміни кількості копій в окремих клітинах ХТК. Порівняння зі зразками первинних і метастатичних пухлин дозволяє відстежувати клональну еволюцію під час прогресування захворювання та лікування. ХТК можуть приховувати мутації резистентності до клінічного виявлення невдачі лікування, що дає змогу втрутитися на ранній стадії.

Аналіз одноклітинних зразків на рівні білків за допомогою імунофлуоресценції або мас-цитометрії характеризує фенотипи ХТК, включаючи статус ЕМТ, маркери проліферації та експресію мішеней лікарських препаратів. Ця інформація допомагає у виборі лікування та моніторингу відповіді на клітинному рівні.

Клінічне застосування та майбутні напрямки

Підрахунок CTC надає прогностичну інформацію для різних типів раку. Підвищення кількості ЦТК корелює з гіршими результатами, а зміни кількості ЦТК під час лікування передбачають відповідь. Серійний моніторинг CTC забезпечує оцінку стану захворювання в режимі реального часу за допомогою мінімально інвазивного забору крові.

Тестування чутливості до препаратів на розширених ЦТК або похідних моделях ЦТК дозволяє персоналізовано підбирати лікування. Вплив ex vivo на пацієнтські КТК терапевтичними препаратами-кандидатами дозволяє визначити ефективні методи лікування до їх клінічного застосування. Цей функціональний підхід прецизійної медицини доповнює геномне профілювання для призначення лікування.

Аутентифікація клітинних ліній підтверджує ідентичність клітинних ліній, отриманих з ЦТК, шляхом порівняння зі зразками пухлин пацієнтів. Тестування на мікоплазму забезпечує цілісність культури протягом усього періоду експансії ПТК. Заморожувальне середовище CM-1 дозволяє зберігати клітини, отримані з ПТК, для поздовжніх досліджень.

Висновок

Технології виділення та культивування циркулюючих пухлинних клітин значно розвинулися, що дозволило отримати доступ до цієї рідкісної, але клінічно важливої клітинної популяції. Різноманітні платформи для виділення дозволяють враховувати рідкісність і фенотипічне різноманіття ПТК, в той час як спеціалізовані умови культивування сприяють збільшенню кількості ПТК для функціональних досліджень. Аналіз одноклітинних клітин дозволяє виявити гетерогенність ЦТК та їх еволюцію під час лікування. Оскільки технології продовжують вдосконалюватися, ЦТК відіграватимуть все більшу роль у прецизійній онкології - від прогностичного підрахунку до функціонального тестування чутливості до лікарських препаратів, що допоможе підібрати персоналізоване лікування.