Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Células tumorales circulantes: técnicas de aislamiento y protocolos de cultivo

Las células tumorales circulantes (CTC) son células cancerosas poco frecuentes que se desprenden de los tumores primarios o de los sitios metastásicos y pasan al torrente sanguíneo. A pesar de su escasez —por lo general, menos de 10 CTC por mililitro de sangre entre miles de millones de células sanguíneas normales—, estas células brindan información invaluable sobre la biología tumoral, los mecanismos metastásicos y la respuesta al tratamiento. Los avances en las tecnologías de aislamiento de CTC y los protocolos de cultivo permiten ahora a los investigadores capturar, contar y caracterizar estas células para aplicaciones de oncología de precisión que van desde el diagnóstico mediante biopsia líquida hasta las pruebas de sensibilidad a medicamentos ex vivo.

Puntos clave

• Las CTC se presentan en frecuencias extremadamente bajas, lo que requiere tecnologías de enriquecimiento altamente sensibles y específicas
• Los métodos de aislamiento aprovechan las propiedades físicas (tamaño, densidad) o los marcadores biológicos (EpCAM) para la captura de las CTC
• El cultivo exitoso de las CTC requiere condiciones especializadas que aborden los desafíos relacionados con la resistencia a la anoikis y la proliferación
• Las líneas celulares y los xenoinjertos derivados de las CTC proporcionan plataformas para pruebas de sensibilidad a medicamentos y estudios mecanísticos
• El análisis unicelular de las CTC revela la heterogeneidad tumoral y la evolución del tumor bajo la presión del tratamiento

Publicado: 2023 | Última revisión: mayo de 2026

El desafío de la rareza de las CTC

Las células tumorales circulantes representan una población extremadamente rara en la sangre periférica; por lo general, se presentan en frecuencias de 1 a 100 células por cada 10 mL de sangre que contiene aproximadamente 50 mil millones de glóbulos rojos y 50 millones de glóbulos blancos. Esta rareza —aproximadamente una CTC por cada millón a diez millones de células sanguíneas nucleadas— exige tecnologías de enriquecimiento altamente sensibles y específicas, capaces de recuperar eventos raros al tiempo que eliminan el vasto fondo de células sanguíneas normales.

La abundancia de CTC se correlaciona con el estadio de la enfermedad; los pacientes con metástasis suelen presentar más CTC que aquellos con enfermedad localizada. Sin embargo, incluso en el cáncer avanzado, las CTC siguen siendo poco frecuentes, y algunos pacientes presentan niveles indetectables de CTC a pesar de una enfermedad metastásica extensa. Esta variabilidad refleja la compleja biología de la intravasación de las células tumorales, su supervivencia en la circulación y su extravasación a sitios distantes.

La importancia clínica de las CTC como biomarcadores pronósticos y predictivos se ha establecido en múltiples tipos de cáncer. La autorización de la FDA del sistema CellSearch para el recuento de CTC en el cáncer de mama, de próstata y colorrectal metastásico validó a las CTC como biomarcadores clínicamente útiles. La investigación continúa ampliando las aplicaciones, desde el recuento hasta la caracterización molecular, lo que permite enfoques de oncología de precisión.

Métodos de aislamiento inmunomagnético

El sistema CellSearch representa la plataforma de referencia, autorizada por la FDA, para el aislamiento de CTC. Este método utiliza microesferas inmunomagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) para capturar células tumorales de origen epitelial. Tras la separación magnética, las CTC se identifican mediante tinción positiva para citoqueratinas y DAPI, mientras que la tinción negativa para el marcador leucocitario CD45 excluye los glóbulos blancos contaminantes.

La captura basada en EpCAM enriquece de manera eficiente las CTC de carcinomas que conservan fenotipos epiteliales, pero puede pasar por alto las CTC que han sufrido una transición epitelial-mesenquimal (EMT) y han reducido la expresión de los marcadores epiteliales. Las subpoblaciones de CTC asociadas a la EMT pueden poseer un mayor potencial metastásico, lo que hace que su detección sea clínicamente importante. Los anticuerpos de captura alternativos o adicionales dirigidos contra marcadores mesenquimales amplían la detección de CTC con fenotipos diversos.

Los enfoques de depleción negativa eliminan las células sanguíneas normales en lugar de seleccionar positivamente las CTC. La depleción basada en CD45 elimina los leucocitos, lo que permite la recuperación de CTC independientemente de la expresión de marcadores epiteliales. Este enfoque captura poblaciones de CTC fenotípicamente diversas, incluidas las células de EMT, pero ofrece una pureza menor que los métodos de selección positiva.

Aislamiento basado en el tamaño y microfluídico

La separación basada en el tamaño aprovecha el mayor diámetro de la mayoría de las CTC (15-25 μm) en comparación con los leucocitos (7-15 μm). La filtración a través de membranas con tamaños de poro definidos (por lo general, 8 μm) retiene las CTC, al tiempo que permite el paso de las células sanguíneas más pequeñas. Este enfoque sin marcadores captura las CTC independientemente de la expresión de marcadores de superficie, pero puede perder las CTC más pequeñas o aquellas con deformabilidad que les permita atravesar los poros.

Los dispositivos microfluídicos permiten un aislamiento sofisticado de las CTC mediante principios integrados de separación física y biológica. El CTC-iChip combina el desplazamiento lateral determinista para el enriquecimiento basado en el tamaño con la eliminación inmunomagnética de los leucocitos. Este enfoque de selección negativa recupera CTC viables sin el uso de marcadores de anticuerpos que podrían interferir con el cultivo o el análisis posterior.

Las plataformas microfluídicas que incorporan anticuerpos anti-EpCAM en las superficies del chip capturan las CTC en condiciones de flujo controladas. Estos dispositivos logran una alta eficiencia de captura al tiempo que permiten la integración con análisis posteriores, incluyendo la inmunotinción en el chip o la liberación de células para su cultivo. Los diseños microfluídicos paralelizados aumentan el rendimiento para aplicaciones clínicas.

Protocolos de cultivo de CTC

El cultivo de CTC presenta desafíos significativos más allá de su escasez. Las células tumorales circulantes deben sobrevivir al desprendimiento de la matriz tumoral primaria, la intravasación, el estrés de cizallamiento circulatorio y el ataque inmunológico, lo que selecciona a las células con propiedades de supervivencia distintivas. Estas sobrevivientes a menudo permanecen inactivas o propensas a la apoptosis en condiciones de cultivo estándar optimizadas para líneas celulares establecidas.

Las condiciones de cultivo de adhesión ultrabaja promueven la supervivencia de las CTC al prevenir el anoikis (apoptosis inducida por el desprendimiento). El cultivo en suspensión en medios para células madre que contienen EGF, FGF e insulina favorece la proliferación de las CTC al tiempo que mantiene sus propiedades iniciadoras de tumores. El cultivo esferoidal tridimensional en estas condiciones enriquece las células con propiedades similares a las de las células madre.

El cultivo hipóxico (1-5 % de O₂) mejora la supervivencia y la proliferación de las CTC en comparación con el oxígeno atmosférico. La hipoxia mantiene las propiedades de las células madre y reduce el estrés oxidativo que podría limitar la expansión de las CTC. La combinación de bajos niveles de oxígeno con medios especializados y factores de crecimiento proporciona condiciones que favorecen el crecimiento de las CTC.

Líneas celulares y xenoinjertos derivados de CTC

El establecimiento exitoso de líneas celulares permanentes derivadas de CTC sigue siendo un reto, con tasas de éxito que suelen estar por debajo del 20 %, incluso en pacientes con metástasis. Cuando se logran, estas líneas celulares proporcionan modelos renovables que representan a la población celular metastásica. Las líneas celulares derivadas de CTC muestran propiedades distintas de las líneas derivadas del tumor primario, lo que refleja la selección que ocurre durante la diseminación metastásica.

Los xenoinjertos derivados de CTC (CDX), generados al inyectar CTC de pacientes en ratones inmunodeficientes, proporcionan modelos in vivo para pruebas de medicamentos y estudios de metástasis. Las tasas de establecimiento de los CDX varían según el tipo de cáncer y la abundancia de CTC, pero se han logrado en múltiples tipos de tumores. Estos modelos conservan las características del tumor del paciente y permiten realizar estudios terapéuticos que no serían posibles con un número limitado de CTC.

Para la investigación comparativa del cáncer, las líneas celulares establecidas proporcionan modelos bien caracterizados. Las células A549 representan el adenocarcinoma de pulmón para la comparación con las CTC del cáncer de pulmón. Las células MCF-7 y las CTC del cáncer de mama permiten la validación de modelos de cáncer de mama. Las células HCT116 proporcionan modelos de referencia para el cáncer colorrectal.

Análisis unicelular de las CTC

El perfil molecular de célula única supera los desafíos de la heterogeneidad de las CTC al analizar células individuales en lugar de poblaciones agrupadas. La secuenciación de ARN de célula única revela la diversidad transcriptómica dentro de las poblaciones de CTC, identificando subpoblaciones con propiedades metastásicas o de resistencia al tratamiento distintivas. Esta heterogeneidad refleja tanto la diversidad intrínseca del tumor como la adaptación al entorno circulatorio.

La secuenciación de ADN a nivel de célula individual identifica mutaciones y alteraciones en el número de copias en CTC individuales. La comparación con muestras de tumores primarios y metastásicos permite seguir la evolución clonal durante la progresión de la enfermedad y el tratamiento. Las CTC pueden albergar mutaciones de resistencia antes de la detección clínica del fracaso del tratamiento, lo que permite una intervención temprana.

El análisis unicelular a nivel proteico mediante inmunofluorescencia o citometría de masas caracteriza los fenotipos de las CTC, incluyendo el estado de la EMT, los marcadores de proliferación y la expresión de dianas farmacológicas. Esta información orienta la selección del tratamiento y permite monitorear la respuesta a nivel unicelular.

Aplicaciones clínicas y perspectivas futuras

El recuento de CTC proporciona información pronóstica en múltiples tipos de cáncer. Un mayor número de CTC se correlaciona con peores resultados, y los cambios en el número de CTC durante el tratamiento predicen la respuesta. El monitoreo serial de las CTC permite evaluar en tiempo real el estado de la enfermedad mediante extracciones de sangre mínimamente invasivas.

Las pruebas de sensibilidad a los fármacos en CTC expandidas o en modelos derivados de CTC permiten la selección de tratamientos personalizados. La exposición ex vivo de las CTC del paciente a terapias candidatas identifica tratamientos eficaces antes de su administración clínica. Este enfoque de medicina de precisión funcional complementa el perfil genómico para orientar el tratamiento.

La autenticación de líneas celulares confirma la identidad de las líneas celulares derivadas de CTC mediante la comparación con muestras tumorales de los pacientes. Las pruebas de micoplasma garantizan la integridad del cultivo durante toda la expansión de las CTC. El medio de congelación CM-1 permite el almacenamiento de células derivadas de CTC para estudios longitudinales.

Conclusión

Las tecnologías de aislamiento y cultivo de células tumorales circulantes han avanzado significativamente, lo que permite acceder a esta población celular poco frecuente pero clínicamente importante. Múltiples plataformas de aislamiento abordan la rareza y la diversidad fenotípica de las CTC, mientras que las condiciones de cultivo especializadas facilitan la expansión de las CTC para estudios funcionales. El análisis de célula única revela la heterogeneidad de las CTC y su evolución durante el tratamiento. A medida que las tecnologías sigan mejorando, las CTC desempeñarán un papel cada vez más importante en la oncología de precisión, desde el recuento pronóstico hasta las pruebas funcionales de sensibilidad a los fármacos que orientan la selección de tratamientos personalizados.