Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

خلايا الأورام المنتشرة: تقنيات العزل وبروتوكولات الاستزراع

تمثّل الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) خلايا سرطانية نادرة تتساقط من الأورام الأولية أو من مواقع النقائل في مجرى الدم. وعلى الرغم من ندرتها - أقل من 10 خلايا سرطانية سرطانية متفرّقة في المليلتر الواحد من الدم بين مليارات خلايا الدم الطبيعية - فإن هذه الخلايا توفر رؤى لا تقدر بثمن في بيولوجيا الورم وآليات الانتقال والاستجابة للعلاج. وتتيح التطورات في تقنيات عزل الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية التائية CTC وبروتوكولات الاستنبات للباحثين الآن التقاط هذه الخلايا وتعدادها وتوصيفها من أجل تطبيقات دقيقة في علم الأورام تتراوح بين تشخيص الخزعة السائلة واختبار حساسية الأدوية خارج الجسم الحي.

الوجبات الرئيسية

• تتواجد الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية الوريدية بترددات منخفضة للغاية وتتطلب تقنيات تخصيب عالية الحساسية ومحددة
• تستغل طرق العزل الخصائص الفيزيائية (الحجم والكثافة) أو العلامات البيولوجية (EpCAM) لالتقاط الخلايا التائية للكريات التائية السرطانية
• تتطلب المزرعة الناجحة للخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المتفرعة ظروفاً متخصصة تعالج تحديات مقاومة الأنويكيس والتكاثر
• توفر خطوط الخلايا المستمدة من الخلايا الكروية السرطانية الوريدية الوريدية المتفرعة والطعوم المجهرية منصات لاختبار حساسية الأدوية والدراسات الآلية
• يكشف تحليل الخلية الواحدة للكريات التائية الوريدية السرطانية عن عدم تجانس الورم وتطوره تحت ضغط العلاج

التحدي المتمثل في ندرة الخلايا السرطانية المنتشرة

تمثل خلايا الأورام السرطانية المنتشرة مجموعة نادرة للغاية في الدم المحيطي، وعادةً ما تحدث بترددات تتراوح بين 1-100 خلية لكل 10 مل من الدم تحتوي على حوالي 50 مليار خلية دم حمراء و50 مليون خلية دم بيضاء. وتتطلب هذه الندرة - ما يقرب من خلية واحدة من الخلايا التائية السرطانية الوريدية الوريدية لكل مليون إلى عشرة ملايين خلية دم نووية - تقنيات تخصيب حساسة للغاية ومحددة قادرة على استرداد الأحداث النادرة مع استنزاف الخلفية الهائلة لخلايا الدم الطبيعية.

وترتبط وفرة الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المنتقلة بمرحلة المرض، حيث عادةً ما يكون لدى المرضى الذين يعانون من النقيليات، عدد أكبر من الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المنتقلة مقارنةً بالمرضى المصابين بمرض موضعي. ومع ذلك، حتى في حالات السرطان المتقدمة، تظل الخلايا المتفرعة السلسلية الوريدية الوريدية المنتقلة نادرة الحدوث، وبعض المرضى لا يمكن اكتشاف الخلايا المتفرعة السلسلية الوريدية الوريدية المنتقلة لديهم على الرغم من انتشار المرض على نطاق واسع. يعكس هذا التباين البيولوجيا المعقدة لانتشار الخلايا السرطانية داخل الخلايا السرطانية وبقائها في الدورة الدموية وانتقالها إلى مواقع بعيدة.

وقد ثبتت الأهمية السريرية للكريات التائية السرطانية الوريدية الوريدية المنتقلة كمؤشرات حيوية تنبؤية وتنبؤية عبر أنواع متعددة من السرطان. وأثبتت موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على نظام CellSearch لتعداد الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المستمرة في سرطان الثدي والبروستاتا وسرطان القولون والمستقيم النقيلي صحة الخلايا السرطانية الوريدية المستمرة كمؤشرات حيوية مفيدة سريريًا. تستمر الأبحاث في توسيع نطاق التطبيقات من التعداد إلى التوصيف الجزيئي الذي يتيح أساليب دقيقة في علم الأورام.

طرق العزل المغناطيسي المناعي

يُمثل نظام CellSearch منصة عزل الخلايا السرطانية الوريدية السرطانية (CTC) المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية. تستخدم هذه الطريقة الخرزات المغناطيسية المناعية المقترنة بالأجسام المضادة لجزيء التصاق الخلايا الظهارية (جزيء التصاق الخلايا الظهارية) لالتقاط الخلايا السرطانية المشتقة من الخلايا الظهارية. وبعد الفصل المغناطيسي، يتم تحديد الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية الوراثية عن طريق التلطيخ الإيجابي للخلايا الخلوية وDAPI، مع تلطيخ سلبي للعلامة CD45 التي تشير إلى الكريات البيضاء، مع استبعاد خلايا الدم البيضاء الملوثة.

يثري الالتقاط المستند إلى EpCAM بكفاءة الخلايا الكروموسومات الوريدية الوريدية الوريدية المتفرعة من الأورام السرطانية التي تحافظ على الأنماط الظاهرية الظهارية، ولكنه قد يفوت الخلايا الكروموسومات الوريدية الوريدية المتفرعة التي خضعت للانتقال الظهاري-متوسط الوَظِيفَة (EMT) وعلامات الظهارة المنخفضة التنظيم. قد تمتلك المجموعات السكانية الفرعية للكريات الليمفاوية الوريدية الوسيطة المرتبطة بالانتقال الظهاري الوسيطي قدرة نقيلية معززة، مما يجعل اكتشافها مهمًا سريريًا. توسع الأجسام المضادة البديلة أو الإضافية التي تستهدف العلامات الوسيطة الوسيطة الوسيطة من نطاق الكشف عن الخلايا الكروموسومات الوريدية الوريدية المتطايرة المتنوعة ظاهرياً.

تُزيل مناهج النضوب السلبي خلايا الدم الطبيعية بدلاً من الانتقاء الإيجابي للكريات التائية السرطانية، وذلك بدلاً من الانتقاء الإيجابي للكريات التائية السرطانية، وهو ما يجعلها ذات قدرة على الكشف عن النقائل. يؤدي النضوب القائم على CD45 إلى إزالة الكريات البيض، مما يتيح استرداد الخلايا الكروموسومات الوريدية التائية للكريات التائية الوريدية المنتقلة بشكل مستقل عن تعبير العلامات الظهارية. ويلتقط هذا النهج مجموعات متنوعة ظاهرياً من الخلايا السرطانية، بما في ذلك خلايا EMT، ولكنه يوفر نقاءً أقل من طرق الانتقاء الإيجابي.

العزل المستند إلى الحجم والعزل القائم على الموائع الدقيقة

يستغل الفصل المستند إلى الحجم القطر الأكبر لمعظم الخلايا التائية السرطانية الوريدية الوريدية (15-25 ميكرومتر) مقارنةً بالخلايا البيضاء (7-15 ميكرومتر). يحتفظ الترشيح من خلال أغشية ذات أحجام مسام محددة (عادةً 8 ميكرومتر) بالكريات التائية السرطانية، بينما يسمح بمرور خلايا الدم الأصغر حجمًا. ويلتقط هذا النهج الخالي من الملصقات الخلايا الكروموسومية الوريدية الانتقالية بغض النظر عن تعبير العلامات السطحية، ولكنه قد يفقد الخلايا الكروموسومية الوريدية الانتقالية الأصغر أو الخلايا الكروموسومية الوريدية الانتقالية ذات القابلية للتشوه التي تسمح بالمرور عبر المسام.

تتيح الأجهزة الميكروفلويديّة الدقيقة إمكانية عزل الخلايا التكوينية الوريدية الوريدية السرطانية المتطورة من خلال مبادئ الفصل الفيزيائية والبيولوجية المتكاملة. تجمع رقاقة CTC-iChip بين الإزاحة الجانبية الحتمية للإثراء القائم على الحجم مع الاستنزاف المغناطيسي المناعي للكريات البيضاء. يستعيد نهج الانتقاء السلبي هذا الخلايا الانتقالية للكريات الليمفاوية الوريدية الوراثية القابلة للحياة دون وضع ملصقات الأجسام المضادة التي قد تتداخل مع المزرعة أو التحليل النهائي.

تلتقط منصات الموائع الدقيقة التي تحتوي على أجسام مضادة لـ EpCAM على أسطح الرقاقات الخلايا الكروية الوريدية النمطية تحت ظروف تدفق محكومة. تحقق هذه الأجهزة كفاءة عالية في الالتقاط مع تمكين التكامل مع التحليل النهائي بما في ذلك التلوين المناعي على الرقاقة أو إطلاق الخلايا للزراعة. تزيد تصميمات الموائع الدقيقة المتوازية من الإنتاجية للتطبيقات السريرية.

بروتوكولات زراعة الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية

تمثل مزرعة الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المتفرعة تحديات كبيرة تتجاوز ندرتها. يجب أن تنجو الخلايا السرطانية المنتشرة من الانفصال عن مصفوفة الورم الأولية، والتغلغل داخلها، وإجهاد القص في الدورة الدموية، والهجوم المناعي - مما يؤدي إلى اختيار الخلايا ذات خصائص البقاء المتميزة. وغالباً ما تبقى هذه الخلايا الناجية هادئة أو معرضة لموت الخلايا المبرمج في ظروف الاستنبات القياسية المحسّنة لخطوط الخلايا الراسخة.

تعزز ظروف الاستزراع منخفضة التعلق للغاية من بقاء الخلايا التائية للخلايا الجذعية عن طريق منع حدوث موت الخلايا المبرمج الناجم عن الانفصال. تدعم المزرعة المعلقة في وسائط الخلايا الجذعية التي تحتوي على EGF وFGF والأنسولين تكاثر الخلايا التائية السرطانية الوريدية الوريدية مع الحفاظ على خصائص بدء الورم. تُثري مزرعة الخلايا الكروية ثلاثية الأبعاد في هذه الظروف الخلايا ذات الخصائص الشبيهة بالخلايا الجذعية.

تعمل مزرعة نقص الأكسجين (1-5% أوكسجين) على تحسين بقاء الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المزمنة وتكاثرها مقارنةً بالأكسجين الجوي. يحافظ نقص الأكسجين على خصائص الخلايا الجذعية ويقلل من الإجهاد التأكسدي الذي قد يحد من توسع الخلايا التائية التائية الوريدية السرطانية. يوفر الجمع بين الأكسجين المنخفض مع الوسائط المتخصصة وعوامل النمو ظروفًا مواتية لنمو الخلايا التائية التائية التاجية.

سلالات الخلايا المستمدة من الخلايا التائية السرطانية الوريدية الوريدية الوريدية والطعوم الغريبة

لا يزال الإنشاء الناجح لخطوط خلايا دائمة مشتقة من الخلايا الكروموسومية الوريدية التائية CTC يمثل تحدياً، حيث تقل معدلات النجاح عادةً عن 20% حتى من المرضى الذين يعانون من النقائل. وعند تحقيق ذلك، توفر هذه الخطوط الخلوية نماذج متجددة تمثل مجموعة الخلايا النقيلية. تُظهر سلالات الخلايا المشتقة من الخلايا الكروموسومية الوريدية الوريدية المتفرعة خصائص تختلف عن السلالات المشتقة من الأورام الأولية، مما يعكس الانتقاء أثناء الانتشار النقيلي.

توفر الطعوم المستمدة من الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية الوريدية المتفرعة المستمدة من الخلايا السرطانية الوريدية المتشعبة (CDX) التي تم إنشاؤها عن طريق حقن الخلايا الوريدية الوريدية المتشعبة للمريض في فئران تعاني من نقص المناعة نماذج حية لاختبار الأدوية ودراسات النقائل. تختلف معدلات إنشاء CDX حسب نوع السرطان ووفرة الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية السرطانية ولكن تم تحقيقها عبر أنواع متعددة من الأورام. تحافظ هذه النماذج على خصائص أورام المريض وتتيح إجراء دراسات علاجية غير ممكنة مع أعداد محدودة من الخلايا الوريدية السرطانية الوريدية المنتقلة.

بالنسبة لأبحاث السرطان المقارنة، توفر خطوط الخلايا الراسخة نماذج مميزة بشكل جيد. تمثل الخلايا A549 خلايا A549 سرطان غدي رئوي للمقارنة مع الخلايا السرطانية الوريدية التائية للكريات الليمفاوية السرطانية الرئوية. تمكّن خلايا MCF-7 CTCs من التحقق من صحة نموذج سرطان الثدي. توفر خلايا HCT116 نماذج مرجعية لسرطان القولون والمستقيم.

تحليل الخلايا أحادية الخلية للصور النمطية للكريات التائية للسرطان

يتغلب التنميط الجزيئي أحادي الخلية على تحديات عدم تجانس الخلايا الكروموسومية الوريدية السرطانية من خلال تحليل الخلايا الفردية بدلاً من تحليل مجموعات الخلايا المجمعة. ويكشف تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية عن تنوع النسخ الجزيئي داخل مجموعات الخلايا السرطانية، ويحدد المجموعات السكانية الفرعية ذات الخصائص المميزة للورم النقيلي أو المقاومة للعلاج. يعكس هذا التغاير كلاً من التنوع الجوهري للورم والتكيف مع بيئة الدورة الدموية.

يحدد تسلسل الحمض النووي أحادي الخلية الطفرات وتغييرات عدد النسخ في الخلايا السرطانية الوراثية الوراثية المفردة. وتتتبع المقارنة مع عينات الأورام الأولية والنقيلية تطور النسيلة أثناء تطور المرض والعلاج. قد تحتوي الخلايا السرطانية الوراثية السرطانية على طفرات مقاومة قبل الكشف السريري عن فشل العلاج، مما يتيح التدخل المبكر.

يميز تحليل الخلية المفردة على مستوى البروتين باستخدام التألق المناعي أو قياس الكتلة الخلوية الأنماط الظاهرية للكريات الليمفاوية السرطانية الوريدية الوريدية بما في ذلك حالة التحول الوراثي EMT وعلامات الانتشار والتعبير الدوائي المستهدف. توجه هذه المعلومات اختيار العلاج وترصد الاستجابة على مستوى الخلية الواحدة.

التطبيقات السريرية والتوجهات المستقبلية

يوفر تعداد الخلايا السرطانية الوريدية المتفرعة CTC معلومات تنبؤية عبر أنواع متعددة من السرطان. ويرتبط ارتفاع تعداد الخلايا السرطانية الوريدية السرطانية المتفرعة بالنتائج الأسوأ، وتتنبأ التغيرات في أعداد الخلايا السرطانية المتفرعة أثناء العلاج بالاستجابة. وتوفر المراقبة التسلسلية للكريات التسلسلية السرطانية الوريدية الوريدية المتفرعة تقييماً لحالة المرض في الوقت الحقيقي من خلال عمليات سحب الدم الأقل توغلاً.

يتيح اختبار الحساسية للأدوية على الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المتفرعة أو النماذج المشتقة من الخلايا السرطانية الوريدية المتفرعة اختيار العلاج الشخصي. كما أن تعريض الخلايا الكروموسومات الوريدية السلسلية السرطانية للمريض خارج الجسم الحي للعلاجات المرشحة يحدد العلاجات الفعالة قبل إعطائها سريريًا. ويُكمّل هذا النهج الوظيفي للطب الدقيق هذا التنميط الجينومي لتوجيه العلاج.

تؤكدمصادقة خط الخلايا على هوية خط الخلايا المستمدة من الخلايا الكروموسومية الوريدية التائية من خلال المقارنة مع عينات أورام المرضى. ويضمن اختبار الميكوبلازما سلامة المزرعة طوال فترة توسع الخلايا التائية الخلوية السرطانية. يتيح التجميد المتوسط CM-1 إمكانية تخزين الخلايا المشتقة من الخلايا التكوينية الوريدية السرطانية CTC للدراسات الطولية.

الخلاصة

تطورت تقنيات عزل خلايا الأورام السرطانية المنتشرة وزراعتها بشكل كبير، مما أتاح الوصول إلى هذه المجموعة الخلوية النادرة والمهمة سريرياً. وتتعامل منصات العزل المتعددة مع ندرة الخلايا السرطانية الوريدية الوريدية المتفرعة وتنوع أنماطها الظاهرية، بينما تدعم ظروف الاستنبات المتخصصة توسيع الخلايا الوريدية الوريدية المتفرعة لإجراء دراسات وظيفية. ويكشف تحليل الخلية الواحدة عن عدم تجانس الخلايا الكروموسومية الوريدية الوريدية السرطانية وتطورها أثناء العلاج. مع استمرار تحسن التقنيات، ستلعب الخلايا الكروموسومات الوريدية السرطانية الوراثية أدواراً متزايدة في علم الأورام الدقيق، بدءاً من التعداد التشخيصي إلى اختبار الحساسية الوظيفية للأدوية التي توجه اختيار العلاج الشخصي.