Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Cirkulējošās audzēju šūnas: Izolēšanas metodes un kultivēšanas protokoli

Cirkulējošās audzēja šūnas (CTC) ir retas vēža šūnas, kas no primārajiem audzējiem vai metastātiskām vietām nonāk asinsritē. Neraugoties uz to retumu - parasti mazāk nekā 10 CTC mililitrā asins starp miljardiem normālu asins šūnu - šīs šūnas sniedz nenovērtējamu ieskatu audzēja bioloģijā, metastāžu mehānismos un atbildes reakcijā uz ārstēšanu. CTC izolēšanas tehnoloģiju un kultūru protokolu attīstība tagad ļauj pētniekiem iegūt, uzskaitīt un raksturot šīs šūnas, lai precīzās onkoloģijas vajadzībām varētu izmantot tās, sākot no šķidrās biopsijas diagnostikas līdz zāļu jutības testēšanai ex vivo.

Galvenie secinājumi

• CTC sastopamas ārkārtīgi reti, tāpēc nepieciešamas ļoti jutīgas un specifiskas bagātināšanas tehnoloģijas
• Izolēšanas metodes izmanto fizikālās īpašības (izmērs, blīvums) vai bioloģiskos marķierus (EpCAM), lai iegūtu CTC
• Veiksmīgai CTC kultivēšanai ir nepieciešami specializēti apstākļi, lai risinātu rezistences pret anoikisi un proliferācijas problēmas
• No CTC iegūtas šūnu līnijas un ksenogrāfti nodrošina platformas jutības pret zālēm testēšanai un mehānistiskiem pētījumiem
• Vienšūnu CTC analīze atklāj audzēja heterogenitāti un attīstību ārstēšanas spiediena ietekmē

CTC retuma problēma

Cirkulējošās audzēja šūnas ir ārkārtīgi reta populācija perifērajās asinīs, parasti tās sastopamas ar 1-100 šūnu biežumu 10 ml asins, kas satur aptuveni 50 miljardus eritrocītu un 50 miljonus balto asinsķermenīšu. Šāds retums - aptuveni viens CTC uz miljonu līdz desmit miljoniem kodolšūnu - prasa ļoti jutīgas un specifiskas bagātināšanas tehnoloģijas, kas spēj atpazīt retos gadījumus, vienlaikus izslēdzot plašo normālo asins šūnu fonu.

CTC daudzums korelē ar slimības stadiju, un metastātisku slimību pacientiem parasti ir vairāk CTC nekā pacientiem ar lokalizētu slimību. Tomēr pat progresējoša vēža gadījumā CTC joprojām ir reti sastopami, un dažiem pacientiem, neraugoties uz plašo metastātisko slimību, CTC nav nosakāmi. Šī mainība atspoguļo audzēja šūnu intravazācijas, izdzīvošanas cirkulācijā un ekstravazācijas uz attālām vietām sarežģīto bioloģiju.

CTC kā prognostisko un prognozējošo biomarķieru klīniskā nozīme ir konstatēta dažādos vēža veidos. FDA atļauja CellSearch sistēmai CTC uzskaitīšanai metastātiska krūts, prostatas un kolorektālā vēža gadījumā apstiprināja CTC kā klīniski noderīgus biomarķierus. Turpinās pētījumi, kas paplašina lietojumu klāstu, sākot no uzskaites līdz molekulārai raksturošanai, kas ļauj izmantot precīzas onkoloģijas pieejas.

Imūnmagnētiskās izolācijas metodes

CellSearch sistēma ir zelta standarta CTC izolācijas platforma, ko apstiprinājusi FDA. Šajā metodē izmanto imunomagnētiskās lodītes, kas konjugētas ar anti-EpCAM (epitēlija šūnu adhēzijas molekulas) antivielām, lai uztvertu epitēlija izcelsmes audzēja šūnas. Pēc magnētiskās separācijas CTC identificē, pozitīvi iekrāsojot ar citokeratīniem un DAPI, negatīvi iekrāsojot ar leikocītu marķieri CD45, kas izslēdz piesārņojošās baltās asins šūnas.

Uz EpCAM balstīta uztveršana efektīvi bagātina CTC no karcinomām, kas saglabā epitēlija fenotipus, bet var izlaist CTC, kas ir pārcietuši epitēlija-mezenhimālo pāreju (EMT) un kuru epitēlija marķieru līmenis ir pazemināts. Ar EMT saistītām CTC subpopulācijām var būt lielāks metastātisks potenciāls, tāpēc to noteikšana ir klīniski svarīga. Alternatīvas vai papildu uztveršanas antivielas, kas vērstas pret mezenhimatiskiem marķieriem, paplašina fenotipiski daudzveidīgu CTC noteikšanu.

Ar negatīvās deplēcijas metodēm tiek atdalītas normālas asins šūnas, nevis pozitīvi atlasīti CTC. CD45 balstīta deplecija likvidē leikocītus, ļaujot atgūt CTC neatkarīgi no epitēlija marķieru ekspresijas. Šī pieeja ļauj iegūt fenotipiski daudzveidīgas CTC populācijas, tostarp EMT šūnas, bet nodrošina zemāku tīrību nekā pozitīvās atlases metodes.

Izolēšana pēc izmēra un mikrofluidālā metode

Atdalīšana, pamatojoties uz izmēru, izmanto lielākās daļas CTC lielāku diametru (15-25 μm) salīdzinājumā ar leikocītiem (7-15 μm). Filtrējot caur membrānām ar noteikta lieluma porām (parasti 8 μm), CTC tiek aizturēti, bet mazākas asins šūnas var izlaist. Šī bezmarķējuma pieeja ļauj uztvert CTC neatkarīgi no virsmas marķieru ekspresijas, bet var zaudēt mazākus CTC vai CTC ar deformējamu struktūru, kas ļauj iziet cauri porām.

Mikrofluidiskās ierīces ļauj veikt sarežģītu CTC izolāciju, izmantojot integrētus fizikālos un bioloģiskos atdalīšanas principus. CTC-iChip apvieno deterministisku sānu pārvietošanu uz izmēru balstītai bagātināšanai ar imunomagnētisku leikocītu izsmelšanu. Šī negatīvās atlases pieeja ļauj atgūt dzīvotspējīgus CTC bez antivielu marķēšanas, kas varētu traucēt turpmāko kultūras vai analīzes procesu.

Mikrofluidiskās platformas, kurās uz mikroshēmu virsmas ir anti-EpCAM antivielas, kontrolētas plūsmas apstākļos uztver CTC. Šīs ierīces nodrošina augstu uztveršanas efektivitāti, vienlaikus ļaujot integrēt ar pakārtoto analīzi, tostarp imūnkrāsošanu uz mikroshēmas vai šūnu atbrīvošanu kultūrai. Paralēliski mikroplūsmas modeļi palielina caurlaides spēju klīniskajiem lietojumiem.

CTC kultūras protokoli

CTC audzēšana ir saistīta ne tikai ar ievērojamām problēmām, bet arī ar to retumu. Cirkulējošām audzēja šūnām ir jāizdzīvo atdalīšanās no primārā audzēja matriksa, intravazācija, cirkulācijas slīdes stress un imūnās sistēmas uzbrukums, lai atlasītu šūnas ar atšķirīgām izdzīvošanas īpašībām. Šīs izdzīvojušās šūnas bieži vien paliek klusas vai pakļautas apoptozei standarta kultivēšanas apstākļos, kas optimizēti izveidotām šūnu līnijām.

Īpaši zemas pieķeršanās kultūras apstākļi veicina CTC izdzīvošanu, novēršot anoikis (atdalīšanas izraisītu apoptozi). Suspensijas kultūras cilmes šūnu barotnē, kas satur EGF, FGF un insulīnu, veicina CTC proliferāciju, vienlaikus saglabājot audzēju ierosinošās īpašības. Trīsdimensiju sferoīdu kultūras šādos apstākļos bagātina šūnas ar cilmes īpašībām.

Hipoksiska kultūra (1-5 % O₂) uzlabo CTC izdzīvošanu un proliferāciju, salīdzinot ar skābekļa atmosfēru. Hipoksija saglabā cilmes šūnu īpašības un samazina oksidatīvo stresu, kas var ierobežot CTC ekspansiju. Zema skābekļa satura kombinācija ar specializētu barotni un augšanas faktoriem nodrošina labvēlīgus apstākļus CTC izaugšanai.

No CTC iegūtas šūnu līnijas un ksenogrāfti

Sekmīga pastāvīgu no CTC atvasinātu šūnu līniju izveide joprojām ir sarežģīts uzdevums, un pat no metastātiskiem pacientiem iegūtās šūnu līnijas parasti ir mazāk nekā 20 % sekmīgas. Kad tas tiek panākts, šīs šūnu līnijas nodrošina atjaunojamus modeļus, kas reprezentē metastātisko šūnu populāciju. No CTC iegūtām šūnu līnijām piemīt īpašības, kas atšķiras no primāro audzēju iegūtajām līnijām, atspoguļojot atlasi metastātiskas izplatīšanās laikā.

No CTC atvasināti ksenogrāfti (CDX), kas iegūti, injicējot pacientu CTC imūndeficītām pelēm, nodrošina in vivo modeļus zāļu testēšanai un metastāžu pētījumiem. CDX izveides rādītāji atšķiras atkarībā no vēža veida un CTC daudzuma, bet tie ir sasniegti vairāku veidu audzējos. Šie modeļi saglabā pacienta audzēja īpašības un ļauj veikt terapeitiskus pētījumus, kas nav iespējami, izmantojot ierobežotu CTC skaitu.

Salīdzinošiem vēža pētījumiem izveidotās šūnu līnijas nodrošina labi raksturotus modeļus. A549 šūnas pārstāv plaušu adenokarcinomu salīdzināšanai ar plaušu vēža CTC. MCF-7 šūnas un krūts vēža CTC ļauj pārbaudīt krūts vēža modeļus. HCT116 šūnas nodrošina kolorektālā vēža references modeļus.

Vienas šūnas CTC analīze

Vienas šūnas molekulārā profilēšana ļauj pārvarēt CTC heterogenitātes problēmas, analizējot atsevišķas šūnas, nevis apvienotas populācijas. Vienas šūnas RNS sekvenēšana atklāj transkriptomu daudzveidību CTC populācijās, identificējot subpopulācijas ar atšķirīgām metastātiskām vai pret ārstēšanu noturīgām īpašībām. Šī heterogenitāte atspoguļo gan raksturīgo audzēju daudzveidību, gan pielāgošanos cirkulācijas videi.

Vienšūnu DNS sekvenēšana identificē mutācijas un kopiju skaita izmaiņas atsevišķos CTC. Salīdzinot ar primāro un metastātisko audzēju paraugiem, var izsekot klonu evolūcijai slimības progresēšanas un ārstēšanas laikā. CTC var būt rezistences mutācijas, pirms klīniski tiek konstatēta ārstēšanas neveiksme, kas ļauj veikt agrīnu iejaukšanos.

Olbaltumvielu līmeņa analīze vienā šūnā, izmantojot imunofluorescenci vai masas citometriju, raksturo CTC fenotipus, tostarp EMT statusu, proliferācijas marķierus un zāļu mērķa ekspresiju. Šī informācija palīdz izvēlēties ārstēšanu un kontrolēt atbildes reakciju vienas šūnas līmenī.

Klīniskie lietojumi un nākotnes virzieni

CTC uzskaitījums sniedz prognostisku informāciju par dažādiem vēža veidiem. Lielāks CTC skaits korelē ar sliktākiem iznākumiem, un CTC skaita izmaiņas ārstēšanas laikā ļauj prognozēt atbildes reakciju. Seriāla CTC uzraudzība nodrošina slimības stāvokļa novērtēšanu reāllaikā, izmantojot minimāli invazīvu asins ņemšanu.

Zāļu jutības testēšana, izmantojot paplašinātus CTC vai no CTC iegūtus modeļus, ļauj veikt personalizētu ārstēšanas izvēli. Ex vivo pacientu CTC pakļaušana kandidātterapiju iedarbībai identificē efektīvu ārstēšanu pirms klīniskās lietošanas. Šī funkcionālā precīzijas medicīnas pieeja papildina genomisko profilēšanu, lai noteiktu ārstēšanas virzienus.

Šūnu līnijas autentiskuma noteikšana apstiprina CTC atvasināto šūnu līnijas identitāti, salīdzinot ar pacientu audzēju paraugiem. Mikoplazmas testēšana nodrošina kultūras integritāti visā CTC paplašināšanas laikā. Saldēšanas barotne CM-1 ļauj uzglabāt no CTC iegūtas šūnas ilgstošiem pētījumiem.

Secinājumi

Cirkulējošo audzēju šūnu izolēšanas un kultivēšanas tehnoloģijas ir ievērojami attīstījušās, nodrošinot piekļuvi šai retajai, bet klīniski nozīmīgajai šūnu populācijai. Vairākas izolācijas platformas risina CTC retuma un fenotipiskās daudzveidības problēmu, savukārt specializēti kultūras apstākļi atbalsta CTC paplašināšanu funkcionāliem pētījumiem. Vienas šūnas analīze atklāj CTC heterogenitāti un to attīstību ārstēšanas laikā. Tehnoloģijām turpinot pilnveidoties, CTC būs aizvien lielāka nozīme precīzajā onkoloģijā, sākot no prognostiskās uzskaites līdz funkcionālai jutības pret zālēm testēšanai, kas palīdzēs izvēlēties individualizētu ārstēšanu.