Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Células Tumorais Circulantes: Técnicas de isolamento e protocolos de cultura

As células tumorais circulantes (CTCs) representam células cancerígenas raras libertadas de tumores primários ou locais metastáticos para a corrente sanguínea. Apesar da sua escassez - normalmente menos de 10 CTCs por mililitro de sangue entre milhares de milhões de células sanguíneas normais - estas células fornecem informações valiosas sobre a biologia do tumor, os mecanismos metastáticos e a resposta ao tratamento. Os avanços nas tecnologias de isolamento de CTCs e nos protocolos de cultura permitem agora aos investigadores capturar, enumerar e caraterizar estas células para aplicações oncológicas de precisão que vão desde o diagnóstico por biópsia líquida até ao teste de sensibilidade a fármacos ex vivo.

Principais conclusões

• As CTC ocorrem em frequências extremamente baixas, exigindo tecnologias de enriquecimento altamente sensíveis e específicas
• Os métodos de isolamento exploram propriedades físicas (tamanho, densidade) ou marcadores biológicos (EpCAM) para a captura de CTC
• Uma cultura de CTC bem sucedida requer condições especializadas para enfrentar os desafios da resistência ao anoikis e da proliferação
• As linhas celulares derivadas de CTC e os xenoenxertos fornecem plataformas para testes de sensibilidade a fármacos e estudos mecanísticos
• A análise unicelular de CTCs revela a heterogeneidade e a evolução do tumor sob pressão do tratamento

O desafio da raridade das CTC

As células tumorais circulantes representam uma população extremamente rara no sangue periférico, ocorrendo normalmente em frequências de 1-100 células por 10 ml de sangue contendo aproximadamente 50 mil milhões de glóbulos vermelhos e 50 milhões de glóbulos brancos. Esta raridade - cerca de uma CTC por milhão a dez milhões de células sanguíneas nucleadas - exige tecnologias de enriquecimento altamente sensíveis e específicas, capazes de recuperar eventos raros, ao mesmo tempo que eliminam o vasto historial de células sanguíneas normais.

A abundância de CTC está correlacionada com o estádio da doença, sendo que os doentes metastáticos têm normalmente mais CTC do que os doentes com doença localizada. No entanto, mesmo no cancro avançado, as CTC continuam a ser raras e alguns doentes têm CTC indetectáveis, apesar da doença metastática extensa. Esta variabilidade reflecte a biologia complexa do intravasamento das células tumorais, a sobrevivência em circulação e o extravasamento para locais distantes.

A importância clínica das CTCs como biomarcadores prognósticos e preditivos foi estabelecida em vários tipos de cancro. A aprovação do sistema CellSearch pela FDA para a contagem de CTCs em cancro da mama, da próstata e colorrectal metastático validou as CTCs como biomarcadores clinicamente úteis. A investigação continua a expandir as aplicações, desde a contagem à caraterização molecular, permitindo abordagens de oncologia de precisão.

Métodos de isolamento imunomagnético

O sistema CellSearch representa a plataforma de isolamento de CTCs padrão-ouro aprovada pela FDA. Este método utiliza esferas imunomagnéticas conjugadas com anticorpos anti-EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) para capturar células tumorais derivadas de células epiteliais. Após a separação magnética, as CTC são identificadas por coloração positiva para citoqueratinas e DAPI, com coloração negativa para o marcador de leucócitos CD45, excluindo os glóbulos brancos contaminantes.

A captura baseada em EpCAM enriquece eficazmente as CTC de carcinomas que mantêm fenótipos epiteliais, mas pode não detetar CTC que tenham sofrido uma transição epitelial-mesenquimal (EMT) e que tenham desregulado marcadores epiteliais. As subpopulações de CTC associadas à EMT podem ter um maior potencial metastático, tornando a sua deteção clinicamente importante. Anticorpos de captura alternativos ou adicionais que visam marcadores mesenquimais expandem a deteção de CTCs fenotipicamente diversas.

As abordagens de depleção negativa removem as células sanguíneas normais em vez de selecionar positivamente as CTC. A depleção baseada no CD45 remove os leucócitos, permitindo a recuperação de CTCs independentemente da expressão de marcadores epiteliais. Esta abordagem capta populações de CTC fenotipicamente diversas, incluindo células EMT, mas proporciona uma pureza inferior à dos métodos de seleção positiva.

Isolamento com base no tamanho e microfluídico

A separação baseada no tamanho explora o maior diâmetro da maioria das CTC (15-25 μm) em comparação com os leucócitos (7-15 μm). A filtração através de membranas com tamanhos de poro definidos (normalmente 8 μm) retém as CTC, permitindo a passagem de células sanguíneas mais pequenas. Esta abordagem sem marcadores capta as CTC independentemente da expressão do marcador de superfície, mas pode perder CTC mais pequenas ou CTC com deformabilidade que permita a passagem através dos poros.

Os dispositivos microfluídicos permitem um isolamento sofisticado de CTC através de princípios de separação física e biológica integrados. O CTC-iChip combina a deslocação lateral determinística para o enriquecimento baseado no tamanho com a depleção imunomagnética de leucócitos. Esta abordagem de seleção negativa recupera CTC viáveis sem marcação de anticorpos que possam interferir com a cultura ou análise a jusante.

As plataformas microfluídicas que incorporam anticorpos anti-EpCAM nas superfícies dos chips capturam CTCs em condições de fluxo controlado. Estes dispositivos alcançam uma elevada eficiência de captura, permitindo simultaneamente a integração com análises a jusante, incluindo a imunomarcação no chip ou a libertação de células para cultura. As concepções microfluídicas paralelas aumentam o rendimento das aplicações clínicas.

Protocolos de cultura de CTC

A cultura de CTC apresenta desafios significativos para além da sua raridade. As células tumorais em circulação têm de sobreviver ao descolamento da matriz tumoral primária, ao intravasamento, ao stress de cisalhamento circulatório e ao ataque imunitário - selecionando células com propriedades de sobrevivência distintas. Estas sobreviventes permanecem frequentemente quiescentes ou propensas a apoptose em condições de cultura padrão optimizadas para linhas celulares estabelecidas.

As condições de cultura de fixação ultra-baixa promovem a sobrevivência das CTC, prevenindo o anoikis (apoptose induzida pela descolagem). A cultura em suspensão em meios de células estaminais contendo EGF, FGF e insulina apoia a proliferação de CTC, mantendo as propriedades de iniciação do tumor. A cultura tridimensional de esferóides nestas condições enriquece as células com propriedades estaminais.

A cultura hipóxica (1-5% O₂) melhora a sobrevivência e a proliferação das CTC em comparação com o oxigénio atmosférico. A hipóxia mantém as propriedades das células estaminais e reduz o stress oxidativo que pode limitar a expansão das CTC. A combinação de baixo oxigénio com meios especializados e factores de crescimento proporciona condições que favorecem o crescimento das CTC.

Linhas celulares derivadas de CTC e xenoenxertos

O estabelecimento bem sucedido de linhas celulares permanentes derivadas de CTC continua a ser um desafio, com taxas de sucesso tipicamente inferiores a 20%, mesmo em doentes metastáticos. Quando conseguidas, estas linhas celulares fornecem modelos renováveis que representam a população de células metastáticas. As linhas celulares derivadas de CTC demonstram propriedades distintas das linhas derivadas de tumores primários, reflectindo a seleção durante a disseminação metastática.

Os xenoenxertos derivados de CTC (CDX) gerados pela injeção de CTC de doentes em ratinhos imunodeficientes fornecem modelos in vivo para testes de medicamentos e estudos de metástases. As taxas de estabelecimento de CDX variam consoante o tipo de cancro e a abundância de CTC, mas foram alcançadas em vários tipos de tumores. Estes modelos mantêm as caraterísticas dos tumores dos doentes e permitem estudos terapêuticos que não são possíveis com números limitados de CTC.

Para a investigação comparativa do cancro, as linhas celulares estabelecidas fornecem modelos bem caracterizados. As células A549 representam o adenocarcinoma do pulmão para comparação com as CTC do cancro do pulmão. As células MCF-7 e as CTC de cancro da mama permitem a validação de modelos de cancro da mama. As células HCT116 fornecem modelos de referência para o cancro colorrectal.

Análise unicelular de CTCs

O perfil molecular de célula única supera os desafios da heterogeneidade das CTC, analisando células individuais em vez de populações agrupadas. A sequenciação de ARN de célula única revela a diversidade transcriptómica nas populações de CTC, identificando subpopulações com propriedades metastáticas ou de resistência ao tratamento distintas. Esta heterogeneidade reflecte tanto a diversidade intrínseca do tumor como a adaptação ao ambiente circulatório.

A sequenciação de ADN de célula única identifica mutações e alterações do número de cópias em CTCs individuais. A comparação com amostras de tumores primários e metastáticos regista a evolução clonal durante a progressão da doença e o tratamento. As CTCs podem conter mutações de resistência antes da deteção clínica de falha do tratamento, permitindo uma intervenção precoce.

A análise de uma única célula ao nível das proteínas, utilizando imunofluorescência ou citometria de massa, caracteriza os fenótipos das CTC, incluindo o estado EMT, marcadores de proliferação e expressão de alvos de fármacos. Esta informação orienta a seleção do tratamento e monitoriza a resposta ao nível de uma única célula.

Aplicações clínicas e direcções futuras

A contagem de CTC fornece informações de prognóstico em vários tipos de cancro. Contagens mais elevadas de CTC estão correlacionadas com piores resultados, e as alterações no número de CTC durante o tratamento prevêem a resposta. A monitorização em série de CTC permite uma avaliação em tempo real do estado da doença através de colheitas de sangue minimamente invasivas.

O teste de sensibilidade a fármacos em CTCs expandidas ou modelos derivados de CTCs permite uma seleção personalizada do tratamento. A exposição ex vivo de CTCs de doentes a terapêuticas candidatas identifica tratamentos eficazes antes da administração clínica. Esta abordagem de medicina de precisão funcional complementa a caraterização genómica para orientação do tratamento.

A autenticação da linha celular confirma a identidade da linha celular derivada de CTC através da comparação com amostras de tumores de doentes. O teste de micoplasma assegura a integridade da cultura durante a expansão das CTC. O Freeze Medium CM-1 permite o armazenamento de células derivadas de CTC para estudos longitudinais.

Conclusão

As tecnologias de isolamento e cultura de células tumorais circulantes avançaram significativamente, permitindo o acesso a esta população celular rara mas clinicamente importante. As múltiplas plataformas de isolamento abordam a raridade e a diversidade fenotípica das CTC, enquanto as condições de cultura especializadas permitem a expansão das CTC para estudos funcionais. A análise de uma única célula revela a heterogeneidade das CTC e a sua evolução durante o tratamento. À medida que as tecnologias continuam a melhorar, as CTC desempenharão um papel cada vez mais importante na oncologia de precisão, desde a enumeração prognóstica até ao teste funcional de sensibilidade aos medicamentos, orientando a seleção personalizada do tratamento.