Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Cirkulirajoče tumorske celice: Tehnike izolacije in protokoli gojenja

Krožeče tumorske celice (CTC) so redke rakave celice, ki se iz primarnih tumorjev ali metastatskih žarišč izločajo v krvni obtok. Kljub njihovi redkosti - običajno je med milijardami normalnih krvnih celic manj kot 10 CTC na mililiter krvi - te celice zagotavljajo neprecenljiv vpogled v biologijo tumorjev, mehanizme metastaziranja in odziv na zdravljenje. Napredek v tehnologijah izolacije CTC in protokolih gojenja zdaj raziskovalcem omogoča, da te celice zajamejo, preštejejo in opišejo za uporabo v precizni onkologiji, od diagnostike s tekočo biopsijo do testiranja občutljivosti na zdravila ex vivo.

Ključne ugotovitve

• CTC se pojavljajo z izjemno nizko frekvenco, kar zahteva zelo občutljive in specifične tehnologije obogatitve
• Metode izolacije izkoriščajo fizikalne lastnosti (velikost, gostota) ali biološke označevalce (EpCAM) za zajem CTC
• Za uspešno gojenje CTC so potrebni posebni pogoji, v katerih je treba obravnavati izzive odpornosti na anoikis in proliferacije
• Celične linije in ksenografti, pridobljeni iz CTC, zagotavljajo platforme za testiranje občutljivosti na zdravila in mehanistične študije
• Enocelična analiza CTC razkriva heterogenost in razvoj tumorja pod pritiskom zdravljenja

Izziv redkosti CTC

Cirkulirajoče tumorske celice so izjemno redka populacija v periferni krvi, ki se običajno pojavlja s frekvenco 1-100 celic na 10 ml krvi, ki vsebuje približno 50 milijard eritrocitov in 50 milijonov belih krvničk. Ta redkost - približno en CTC na milijon do deset milijonov nukleiranih krvnih celic - zahteva zelo občutljive in specifične tehnologije obogatitve, s katerimi je mogoče obnoviti redke dogodke, hkrati pa izločiti obsežno ozadje normalnih krvnih celic.

Številčnost CTC je povezana s stadijem bolezni, pri čemer imajo bolniki z metastazami običajno več CTC kot bolniki z lokalizirano boleznijo. Vendar so CTC tudi pri napredovalem raku redki, pri nekaterih bolnikih pa CTC kljub obsežni metastatski bolezni ni mogoče odkriti. Ta spremenljivost odraža zapleteno biologijo intravazacije tumorskih celic, preživetje v obtoku in ekstravazacijo na oddaljena mesta.

Klinični pomen CTC kot prognostičnih in napovednih biomarkerjev je bil ugotovljen pri več vrstah raka. FDA je odobrila sistem CellSearch za določanje števila CTC pri metastatskem raku dojke, prostate in debelega črevesa ter tako potrdila CTC kot klinično uporabne biomarkerje. Raziskave se nadaljujejo in širijo uporabo od štetja do molekularne karakterizacije, ki omogoča natančne onkološke pristope.

Imunomagnetne izolacijske metode

Sistem CellSearch predstavlja zlato standardno platformo za izolacijo CTC, ki jo je odobrila FDA. Ta metoda uporablja imunomagnetne kroglice, konjugirane s protitelesi anti-EpCAM (adhezijska molekula epitelijskih celic), za zajem epitelijskih tumorskih celic. Po magnetni separaciji se CTC identificirajo s pozitivnim barvanjem za citokeratine in DAPI, z negativnim barvanjem za levkocitni označevalec CD45, ki izključuje kontaminirane bele krvničke.

Zajem na podlagi EpCAM učinkovito obogati CTC iz karcinomov, ki ohranjajo epitelijske fenotipe, vendar lahko spregleda CTC, ki so prešli skozi epitelijsko-mezenhimski prehod (EMT) in so znižali raven epitelijskih označevalcev. Subpopulacije CTC, povezane z EMT, imajo lahko večji metastatski potencial, zato je njihovo odkrivanje klinično pomembno. Alternativna ali dodatna zajemalna protitelesa, usmerjena proti mezenhimskim označevalcem, razširjajo odkrivanje fenotipsko raznolikih CTC.

Pristopi negativnega izčrpavanja odstranijo normalne krvne celice, namesto da bi pozitivno izbirali CTC. Deplecija na podlagi CD45 odstrani levkocite, kar omogoča pridobivanje CTC neodvisno od izražanja epitelijskih označevalcev. Ta pristop zajame fenotipsko raznolike populacije CTC, vključno s celicami EMT, vendar zagotavlja manjšo čistost kot metode pozitivne selekcije.

Izolacija na podlagi velikosti in mikrofluidna izolacija

Ločevanje na podlagi velikosti izkorišča večji premer večine CTC (15-25 μm) v primerjavi z levkociti (7-15 μm). Filtriranje skozi membrane z določeno velikostjo por (običajno 8 μm) zadrži CTC, medtem ko prepusti manjše krvne celice. Ta pristop brez označevanja zajame CTC ne glede na izražanje površinskih označevalcev, vendar lahko izgubi manjše CTC ali CTC z deformacijo, ki omogoča prehod skozi pore.

Mikrofluidne naprave omogočajo prefinjeno izolacijo CTC z integriranimi fizikalnimi in biološkimi načeli ločevanja. Čip CTC-iChip združuje deterministični bočni premik za obogatitev na podlagi velikosti z imunomagnetnim izločanjem levkocitov. S tem pristopom negativne selekcije se pridobijo vitalni CTC brez označevanja s protitelesi, ki bi lahko oviralo nadaljnje gojenje ali analizo.

Mikrofluidne platforme s protitelesi anti-EpCAM na površinah čipov zajemajo CTC pod nadzorovanimi pogoji pretoka. Te naprave dosegajo visoko učinkovitost zajemanja in hkrati omogočajo integracijo z nadaljnjo analizo, vključno z imunobarvanjem na čipu ali sproščanjem celic za gojenje. Vzporedne mikrofluidne zasnove povečujejo zmogljivost za klinične aplikacije.

Protokoli za gojenje CTC

Kultura CTC poleg njihove redkosti predstavlja tudi velike izzive. Obtočne tumorske celice morajo preživeti ločitev od matriksa primarnega tumorja, intravazacijo, strižni stres v obtoku in imunski napad, pri čemer je treba izbrati celice z izrazitimi lastnostmi preživetja. Te preživele celice pogosto ostanejo mirne ali nagnjene k apoptozi v standardnih pogojih gojenja, optimiziranih za uveljavljene celične linije.

Pogoji gojenja z izjemno nizko stopnjo pritrditve spodbujajo preživetje CTC s preprečevanjem anoikisa (apoptoze, povzročene z odcepitvijo). Suspenzna kultura v mediju za matične celice, ki vsebuje EGF, FGF in inzulin, podpira proliferacijo CTC, hkrati pa ohranja lastnosti sprožitve tumorja. Tridimenzionalna sferoidna kultura v teh pogojih obogati celice z lastnostmi, podobnimi matičnim celicam.

Hipoksična kultura (1-5 % O₂) izboljša preživetje in proliferacijo CTC v primerjavi z atmosferskim kisikom. Hipoksija ohranja lastnosti matičnih celic in zmanjšuje oksidativni stres, ki lahko omejuje širjenje CTC. Kombinacija nizke vsebnosti kisika s specializiranimi gojišči in rastnimi dejavniki zagotavlja pogoje, ki so ugodni za razrast CTC.

Celične linije in ksenografti, pridobljeni iz CTC

Uspešna vzpostavitev trajnih celičnih linij, pridobljenih iz CTC, je še vedno izziv, saj je stopnja uspešnosti običajno pod 20 %, tudi pri bolnikih z metastazami. Ko je to doseženo, te celične linije zagotavljajo obnovljive modele, ki predstavljajo populacijo metastatskih celic. Celične linije, pridobljene iz CTC, imajo lastnosti, ki se razlikujejo od linij, pridobljenih iz primarnih tumorjev, kar kaže na selekcijo med metastatskim širjenjem.

Ksenogrami, pridobljeni s CTC, ki nastanejo z injiciranjem bolnikovih CTC v imunodeficientne miši, zagotavljajo modele in vivo za testiranje zdravil in študije metastaz. Stopnje vzpostavitve CDX se razlikujejo glede na vrsto raka in številčnost CTC, vendar so bile dosežene pri več vrstah tumorjev. Ti modeli ohranjajo značilnosti bolnikovega tumorja in omogočajo terapevtske študije, ki niso mogoče z omejenim številom CTC.

Za primerjalne raziskave raka so uveljavljene celične linije dobro karakterizirani modeli. Celice A549 predstavljajo pljučni adenokarcinom za primerjavo s CTC pljučnega raka. Celice MCF-7 in CTC raka dojke omogočajo validacijo modela raka dojke. Celice HCT116 zagotavljajo referenčne modele raka debelega črevesa in danke.

Enocelična analiza CTC

Enocelično molekularno profiliranje premaguje izzive heterogenosti CTC z analizo posameznih celic in ne združenih populacij. Sekvenciranje RNK v eni celici razkriva transkriptomsko raznolikost znotraj populacij CTC, s čimer se identificirajo subpopulacije z različnimi metastatskimi ali na zdravljenje odpornimi lastnostmi. Ta heterogenost odraža tako notranjo raznolikost tumorjev kot tudi prilagajanje na cirkulacijsko okolje.

Z enokomponentnim sekvenciranjem DNK se ugotavljajo mutacije in spremembe števila kopij v posameznih CTC. Primerjava s primarnimi in metastatskimi vzorci tumorjev omogoča spremljanje klonskega razvoja med napredovanjem bolezni in zdravljenjem. CTC lahko vsebujejo mutacije odpornosti, preden se klinično odkrije neuspešno zdravljenje, kar omogoča zgodnje ukrepanje.

Analiza posameznih celic na ravni beljakovin z uporabo imunofluorescence ali masne citometrije opisuje fenotipe CTC, vključno s statusom EMT, označevalci proliferacije in izražanjem tarčnih zdravil. Te informacije usmerjajo izbiro zdravljenja in spremljajo odziv na ravni posamezne celice.

Klinične aplikacije in prihodnje usmeritve

Številčenje CTC zagotavlja prognostične informacije pri več vrstah raka. Večje število CTC je povezano s slabšim izidom, spremembe števila CTC med zdravljenjem pa napovedujejo odziv. Serijsko spremljanje CTC omogoča oceno stanja bolezni v realnem času z minimalno invazivnimi odvzemi krvi.

Testiranje občutljivosti na zdravila na razširjenih CTC ali modelih, pridobljenih iz CTC, omogoča personalizirano izbiro zdravljenja. Ex vivo izpostavljenost bolnikovih CTC kandidatnim terapijam identificira učinkovita zdravljenja pred klinično uporabo. Ta funkcionalni pristop precizne medicine dopolnjuje genomsko profiliranje za usmerjanje zdravljenja.

Preverjanje pristnosti celičnih linij potrjuje identiteto celičnih linij, pridobljenih iz CTC, s primerjavo z vzorci bolnikovih tumorjev. Testiranje na mikoplazme zagotavlja celovitost kulture med širjenjem CTC. Sredstvo za zamrzovanje CM-1 omogoča shranjevanje celic, pridobljenih iz CTC, za longitudinalne študije.

Zaključek

Tehnologije izolacije in gojenja celic cirkulirajočih tumorjev so močno napredovale, kar omogoča dostop do te redke, vendar klinično pomembne populacije celic. Več platform za izolacijo obravnava redkost in fenotipsko raznolikost CTC, medtem ko specializirani pogoji gojenja podpirajo širjenje CTC za funkcionalne študije. Analiza posameznih celic razkriva heterogenost CTC in njihov razvoj med zdravljenjem. Ker se tehnologije še naprej izboljšujejo, bodo CTC igrali vse večjo vlogo v precizni onkologiji, od prognostičnega naštevanja do funkcionalnega testiranja občutljivosti na zdravila, ki bo usmerjalo personalizirano izbiro zdravljenja.