Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Cirkuliuojančios naviko ląstelės: Išskyrimo būdai ir auginimo protokolai

Cirkuliuojančios naviko ląstelės (CTC) - tai retos vėžio ląstelės, kurios iš pirminių navikų ar metastazių patenka į kraują. Nepaisant to, kad šių ląstelių yra nedaug - paprastai jų būna mažiau nei 10 ląstelių mililitre kraujo tarp milijardų normalių kraujo ląstelių - jos suteikia neįkainojamų žinių apie naviko biologiją, metastazavimo mechanizmus ir atsaką į gydymą. Pažanga CTC išskyrimo technologijų ir kultūrų protokolų srityje dabar leidžia mokslininkams surinkti, suskaičiuoti ir apibūdinti šias ląsteles, kad jas būtų galima naudoti tiksliojoje onkologijoje - nuo skystosios biopsijos diagnostikos iki ex vivo jautrumo vaistams tyrimų.

Pagrindinės išvados

• CTC pasitaiko itin retai, todėl reikia itin jautrių ir specifinių sodrinimo technologijų
• Izoliavimo metodai naudoja fizines savybes (dydį, tankį) arba biologinius žymenis (EpCAM) CTC surinkti
• Sėkmingam CTC auginimui reikalingos specialios sąlygos, kuriomis sprendžiami atsparumo anoikiui ir proliferacijos iššūkiai
• Iš CTC gautos ląstelių linijos ir ksenograftai yra jautrumo vaistams testavimo ir mechanistinių tyrimų platformos
• Vienos ląstelės CTC analizė atskleidžia naviko heterogeniškumą ir evoliuciją esant gydymo spaudimui

KTC retumo iššūkis

Cirkuliuojančios navikinės ląstelės yra itin reta periferinio kraujo populiacija, paprastai jų būna 1-100 ląstelių 10 ml kraujo, kuriame yra maždaug 50 ml raudonųjų ir 50 mln. baltųjų kraujo kūnelių. Dėl tokio retumo - maždaug vienas KTK milijonui ar dešimčiai milijonų branduolinių kraujo kūnelių - reikalingos labai jautrios ir specifinės sodrinimo technologijos, galinčios atkurti retus atvejus, kartu pašalinant didžiulį normalių kraujo kūnelių foną.

KTK gausa priklauso nuo ligos stadijos, o metastazėmis sergantys pacientai paprastai turi daugiau KTK nei tie, kurių liga lokalizuota. Tačiau net ir esant pažengusiam vėžiui CTC yra reti, o kai kurių pacientų CTC neaptinkami, nors metastazės yra labai išplitusios. Šis kintamumas atspindi sudėtingą naviko ląstelių intravazacijos, išgyvenimo cirkuliacijoje ir ekstravazacijos į tolimas vietas biologiją.

Nustatyta, kad klinikinė CTC, kaip prognostinių ir prognozinių biožymenų, reikšmė yra svarbi įvairių tipų vėžiui. FDA leidimas naudoti "CellSearch" sistemą, skirtą metastazavusiam krūties, prostatos ir storosios žarnos vėžiui nustatyti, patvirtino, kad CTC yra kliniškai naudingi biomarkeriai. Moksliniai tyrimai tęsiami ir toliau, plečiant taikymo sritis nuo skaičiavimo iki molekulinio apibūdinimo, leidžiančio taikyti tiksliosios onkologijos metodus.

Imunomagnetinio išskyrimo metodai

"CellSearch" sistema yra auksinis standartas - FDA patvirtinta CTC išskyrimo platforma. Taikant šį metodą, epitelinių ląstelių navikinėms ląstelėms gaudyti naudojami imunomagnetiniai rutuliukai, konjuguoti su antikūnais prieš epitelio ląstelių adhezijos molekulę (anti-EpCAM). Po magnetinio atskyrimo CTC identifikuojamos pagal teigiamą citokeratinų ir DAPI dažymą, o neigiamas leukocitų žymens CD45 dažymas pašalina užterštus baltuosius kraujo kūnelius.

EpCAM pagrindu gaudant CTC iš karcinomų, kuriose išlieka epitelio fenotipai, veiksmingai surenkamos CTC, tačiau gali būti praleistos CTC, kuriose įvyko epitelio-mezenchiminis virsmas (EMT) ir sumažėjo epitelio žymenų reguliacija. Su EMT susijusios CTC subpopuliacijos gali turėti didesnį metastazavimo potencialą, todėl jų aptikimas yra svarbus klinikiniu požiūriu. Alternatyvūs arba papildomi fiksavimo antikūnai, nukreipti į mezenchiminius žymenis, padeda aptikti fenotipiškai skirtingus CTC.

Neigiamos deplecijos metodais pašalinamos normalios kraujo ląstelės, o ne teigiamai atrenkami CTC. CD45 pagrįsta deplecija pašalina leukocitus, todėl CTC galima atkurti nepriklausomai nuo epitelio žymenų raiškos. Šis metodas leidžia surinkti fenotipiškai įvairias CTC populiacijas, įskaitant EMT ląsteles, tačiau jo grynumas yra mažesnis nei teigiamos atrankos metodų.

Izoliavimas pagal dydį ir mikrofluidiniu būdu

Dydžiu pagrįstas atskyrimas grindžiamas tuo, kad daugumos KTK skersmuo yra didesnis (15-25 μm), palyginti su leukocitais (7-15 μm). Filtruojant per membranas su nustatyto dydžio poromis (paprastai 8 μm) CTC sulaikomi, o mažesnės kraujo ląstelės praleidžiamos. Taikant šį beženklį metodą CTC fiksuojami nepriklausomai nuo paviršiaus žymenų raiškos, tačiau gali būti prarandami mažesni CTC arba CTC, kurie gali deformuotis ir prasiskverbti pro poras.

Mikrofluidiniai prietaisai leidžia sudėtingai izoliuoti KTK taikant integruotus fizikinius ir biologinius atskyrimo principus. CTC-iChip sujungia deterministinį šoninį poslinkį, kad būtų galima praturtinti pagal dydį, ir imunomagnetinį leukocitų išskyrimą. Taikant šį neigiamos atrankos metodą, gyvybingi CTC atstatomi be antikūnų žymėjimo, kuris gali trukdyti tolesniam auginimui ar analizei.

Mikrofluidinės platformos, kuriose ant mikroschemų paviršių yra anti-EpCAM antikūnų, gaudo CTC kontroliuojamo srauto sąlygomis. Šiais prietaisais pasiekiamas aukštas surinkimo efektyvumas ir kartu sudaromos sąlygos integruoti juos į tolesnę analizę, įskaitant lusto imunoženklinimą arba ląstelių išleidimą į kultūrą. Lygiagrečiosios mikrofluidinės konstrukcijos padidina klinikinių programų našumą.

KTK auginimo protokolai

CTC auginimas kelia ne tik didelių iššūkių, bet ir jų retumą. Cirkuliuojančios naviko ląstelės turi išgyventi atsiskyrimą nuo pirminio naviko matricos, intravazaciją, cirkuliacinį šlyties stresą ir imuninės sistemos ataką, kad būtų atrinktos ląstelės, pasižyminčios išskirtinėmis išgyvenimo savybėmis. Šios išgyvenusios ląstelės dažnai lieka ramybės būsenoje arba yra linkusios į apoptozę standartinėse kultūrų sąlygose, optimizuotose nustatytoms ląstelių linijoms.

Itin mažo prisitvirtinimo kultūros sąlygos skatina CTC išgyvenamumą, užkirsdamos kelią anoikiui (atskyrimo sukeltai apoptozei). Suspenduotos kultūros kamieninių ląstelių terpėje, kurioje yra EGF, FGF ir insulino, palaiko CTC proliferaciją, tačiau išlaiko naviko inicijavimo savybes. Trimatė sferoidų kultūra tokiomis sąlygomis praturtina ląsteles, pasižyminčias kamieninėms savybėms būdingomis savybėmis.

Hipoksinė kultūra (1-5 % O₂) pagerina CTC išgyvenamumą ir proliferaciją, palyginti su atmosferos deguonimi. Hipoksija išlaiko kamieninių ląstelių savybes ir sumažina oksidacinį stresą, kuris gali riboti CTC plėtrą. Mažo deguonies kiekio derinys su specializuotomis terpėmis ir augimo veiksniais sudaro palankias sąlygas CTC augimui.

CTC išvestos ląstelių linijos ir ksenograftai

Sėkmingai sukurti nuolatines iš CTC gautas ląstelių linijas tebėra sudėtinga, nes sėkmės rodikliai paprastai nesiekia 20 % net iš metastazavusių pacientų. Kai tai pavyksta, šios ląstelių linijos yra atsinaujinantys modeliai, atspindintys metastazinių ląstelių populiaciją. CTC išvestos ląstelių linijos pasižymi savybėmis, kurios skiriasi nuo pirminių naviko išvestų linijų, o tai rodo atranką metastazių plitimo metu.

Iš CTC gautos ksenografijos (CDX), sukurtos įšvirkščiant pacientų CTC į imunodeficitines peles, yra in vivo modeliai vaistų bandymams ir metastazių tyrimams. CDX susidarymo rodikliai skiriasi priklausomai nuo vėžio tipo ir CTC gausos, tačiau jų buvo pasiekta daugelio tipų navikuose. Šie modeliai išlaiko paciento naviko savybes ir leidžia atlikti terapinius tyrimus, kurių neįmanoma atlikti naudojant ribotą CTC skaičių.

Lyginamiesiems vėžio tyrimams sukurtos ląstelių linijos yra gerai apibūdinti modeliai. A549 ląstelės atspindi plaučių adenokarcinomą, kad būtų galima palyginti su plaučių vėžio CTC. MCF-7 ląstelės ir krūties vėžio KTK leidžia patikrinti krūties vėžio modelį. HCT116 ląstelės yra storosios žarnos vėžio etaloniniai modeliai.

Vienos ląstelės CTC analizė

Vienos ląstelės molekulinis profiliavimas padeda įveikti CTC heterogeniškumo problemas, nes analizuojamos atskiros ląstelės, o ne jungtinės populiacijos. Vienos ląstelės RNR sekos nustatymas atskleidžia transkriptominę įvairovę CTC populiacijose, nustatant subpopuliacijas, pasižyminčias skirtingomis metastazių ar atsparumo gydymui savybėmis. Šis heterogeniškumas atspindi tiek būdingą naviko įvairovę, tiek prisitaikymą prie cirkuliacinės aplinkos.

Vienos ląstelės DNR sekoskaitos metodu nustatomos mutacijos ir kopijų skaičiaus pokyčiai atskiruose CTC. Lyginant su pirminių ir metastazinių navikų mėginiais, stebima klonų evoliucija ligos progresavimo ir gydymo metu. CTC gali turėti atsparumo mutacijų prieš klinikinį gydymo nepakankamumo nustatymą, todėl galima anksti įsikišti.

Atskirų ląstelių baltymų lygio analizė naudojant imunofluorescenciją arba masinę citometriją apibūdina KTK fenotipus, įskaitant EMT būklę, proliferacijos žymenis ir vaistų taikinių raišką. Ši informacija padeda parinkti gydymą ir stebėti atsaką vienos ląstelės lygmeniu.

Klinikiniai taikymai ir ateities kryptys

CTC skaičiavimas suteikia prognostinės informacijos apie įvairių tipų vėžį. Didesnis CTC skaičius koreliuoja su blogesne baigtimi, o CTC skaičiaus pokyčiai gydymo metu leidžia prognozuoti atsaką. Serijinė KTK stebėsena leidžia realiuoju laiku įvertinti ligos būklę atliekant minimaliai invazinius kraujo tyrimus.

Jautrumo vaistams tyrimas naudojant išplėstinius CTC arba iš CTC gautus modelius leidžia parinkti individualų gydymą. Ex vivo pacientų KTK veikiant kandidatais į gydymo būdus, prieš pradedant taikyti klinikinį gydymą, nustatomas veiksmingas gydymas. Šis funkcinės tiksliosios medicinos metodas papildo genominį profiliavimą, kad būtų galima nustatyti gydymo gaires.

Ląstelių linijos autentiškumo nustatymas patvirtina CTC išvestos ląstelių linijos tapatumą lyginant su paciento naviko mėginiais. Mikoplazmų tyrimas užtikrina kultūros vientisumą per visą CTC plėtimą. Užšaldymo terpė CM-1 leidžia kaupti iš CTC gautas ląsteles ilgalaikiams tyrimams.

Išvada

Cirkuliuojančių navikinių ląstelių išskyrimo ir kultivavimo technologijos labai patobulėjo, todėl atsirado galimybė gauti šios retos, bet kliniškai svarbios ląstelių populiacijos duomenis. Įvairios išskyrimo platformos padeda spręsti CTC retumo ir fenotipų įvairovės problemą, o specializuotos auginimo sąlygos padeda išplėsti CTC, kad būtų galima atlikti funkcinius tyrimus. Vienos ląstelės analizė atskleidžia CTC heterogeniškumą ir jų evoliuciją gydymo metu. Tobulėjant technologijoms CTC vaidmuo tiksliojoje onkologijoje didės - nuo prognozės nustatymo iki funkcinių jautrumo vaistams tyrimų, kuriais bus vadovaujamasi parenkant individualizuotą gydymą.