Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Cellules tumorales circulantes : techniques d’isolement et protocoles de culture

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont de rares cellules cancéreuses qui se détachent des tumeurs primaires ou des sites métastatiques pour se retrouver dans la circulation sanguine. Malgré leur rareté — généralement moins de 10 CTC par millilitre de sang parmi des milliards de cellules sanguines normales —, ces cellules fournissent des renseignements inestimables sur la biologie tumorale, les mécanismes métastatiques et la réponse au traitement. Les progrès réalisés dans les technologies d’isolement des CTC et les protocoles de culture permettent désormais aux chercheurs de capturer, de dénombrer et de caractériser ces cellules pour des applications en oncologie de précision, allant du diagnostic par biopsie liquide aux tests de sensibilité aux médicaments ex vivo.

Points clés

• Les CTC sont présentes à des fréquences extrêmement faibles, ce qui nécessite des technologies d’enrichissement hautement sensibles et spécifiques
• Les méthodes d’isolement exploitent les propriétés physiques (taille, densité) ou les marqueurs biologiques (EpCAM) pour la capture des CTC
• Une culture réussie des CTC nécessite des conditions spécialisées permettant de surmonter les défis liés à la résistance à l’anoïkise et à la prolifération
• Les lignées cellulaires et les xénogreffes dérivées de CTC constituent des plateformes pour les tests de sensibilité aux médicaments et les études mécanistiques
• L’analyse unicellulaire des CTC révèle l’hétérogénéité tumorale et l’évolution de la tumeur sous la pression thérapeutique

Publié : 2023 | Dernière révision : mai 2026

Le défi posé par la rareté des CTC

Les cellules tumorales circulantes constituent une population extrêmement rare dans le sang périphérique; on les retrouve généralement à des fréquences de 1 à 100 cellules par 10 mL de sang contenant environ 50 milliards de globules rouges et 50 millions de globules blancs. Cette rareté — environ une CTC par million à dix millions de cellules sanguines nucléées — exige des technologies d’enrichissement hautement sensibles et spécifiques, capables de détecter ces événements rares tout en éliminant le vaste bruit de fond constitué par les cellules sanguines normales.

L’abondance des CTC est en corrélation avec le stade de la maladie; les patients atteints d’un cancer métastatique présentent généralement davantage de CTC que ceux dont la maladie est localisée. Cependant, même dans les cancers avancés, les CTC demeurent rares, et certains patients présentent des CTC indétectables malgré une maladie métastatique étendue. Cette variabilité reflète la biologie complexe de l’intravasation des cellules tumorales, de leur survie dans la circulation et de leur extravasation vers des sites distants.

L’importance clinique des CTC en tant que biomarqueurs pronostiques et prédictifs a été établie pour de nombreux types de cancer. L’autorisation accordée par la FDA au système CellSearch pour le dénombrement des CTC dans les cancers métastatiques du sein, de la prostate et du côlon a validé les CTC comme des biomarqueurs cliniquement utiles. La recherche continue d’élargir les applications, passant du simple dénombrement à la caractérisation moléculaire, ce qui permet des approches d’oncologie de précision.

Méthodes d’isolement immunomagnétiques

Le système CellSearch constitue la plateforme de référence approuvée par la FDA pour l’isolement des CTC. Cette méthode utilise des billes immunomagnétiques conjuguées à des anticorps anti-EpCAM (molécule d’adhésion cellulaire épithéliale) pour capturer les cellules tumorales d’origine épithéliale. Après la séparation magnétique, les CTC sont identifiées par une coloration positive aux cytokératines et au DAPI, tandis qu’une coloration négative au marqueur leucocytaire CD45 permet d’exclure les globules blancs contaminants.

La capture basée sur l’EpCAM enrichit efficacement les CTC issues de carcinomes conservant des phénotypes épithéliaux, mais peut ne pas détecter les CTC ayant subi une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et présentant une régulation à la baisse des marqueurs épithéliaux. Les sous-populations de CTC associées à la TEM peuvent posséder un potentiel métastatique accru, ce qui rend leur détection cliniquement importante. Des anticorps de capture alternatifs ou supplémentaires ciblant des marqueurs mésenchymateux élargissent la détection de CTC phénotypiquement diversifiées.

Les approches de déplétion négative éliminent les cellules sanguines normales plutôt que de sélectionner positivement les CTC. La déplétion basée sur le CD45 élimine les leucocytes, permettant ainsi la récupération des CTC indépendamment de l’expression des marqueurs épithéliaux. Cette approche permet de capturer des populations de CTC phénotypiquement diverses, y compris les cellules ayant subi une TEM, mais offre une pureté inférieure à celle des méthodes de sélection positive.

Isolement basé sur la taille et microfluidique

La séparation basée sur la taille exploite le diamètre plus grand de la plupart des CTC (15 à 25 μm) par rapport aux leucocytes (7 à 15 μm). La filtration à travers des membranes dotées de pores de taille définie (généralement 8 μm) retient les CTC tout en laissant passer les cellules sanguines plus petites. Cette approche sans marquage permet de capturer les CTC indépendamment de l’expression des marqueurs de surface, mais peut entraîner la perte des CTC plus petites ou de celles dont la déformabilité leur permet de passer à travers les pores.

Les dispositifs microfluidiques permettent une isolation sophistiquée des CTC grâce à des principes intégrés de séparation physique et biologique. Le CTC-iChip combine un déplacement latéral déterministe pour l’enrichissement basé sur la taille avec une déplétion immunomagnétique des leucocytes. Cette approche de sélection négative permet de récupérer des CTC viables sans marquage par anticorps, ce qui pourrait interférer avec la culture ou l’analyse en aval.

Les plateformes microfluidiques intégrant des anticorps anti-EpCAM à la surface des puces capturent les CTC dans des conditions d’écoulement contrôlées. Ces dispositifs offrent une efficacité de capture élevée tout en permettant l’intégration d’analyses en aval, notamment l’immunocoloration sur puce ou la libération des cellules en vue de leur culture. Les conceptions microfluidiques parallélisées augmentent le débit pour les applications cliniques.

Protocoles de culture des CTC

La culture des CTC présente des défis importants qui vont au-delà de leur rareté. Les cellules tumorales circulantes doivent survivre au détachement de la matrice tumorale primaire, à l’intravasation, aux contraintes de cisaillement circulatoires et aux attaques immunitaires — ce qui sélectionne des cellules dotées de propriétés de survie distinctes. Ces survivantes restent souvent quiescentes ou sujettes à l’apoptose dans des conditions de culture standard optimisées pour des lignées cellulaires établies.

Les conditions de culture à adhérence ultra-faible favorisent la survie des CTC en empêchant l’anoïkise (apoptose induite par le détachement). La culture en suspension dans des milieux pour cellules souches contenant de l’EGF, du FGF et de l’insuline favorise la prolifération des CTC tout en préservant leurs propriétés d’initiation tumorale. La culture tridimensionnelle en sphéroïdes dans ces conditions permet d’enrichir la culture en cellules présentant des propriétés de type souche.

La culture en hypoxie (1 à 5 % d’O₂) améliore la survie et la prolifération des CTC par rapport à l’oxygène atmosphérique. L’hypoxie préserve les propriétés des cellules souches et réduit le stress oxydatif susceptible de limiter l’expansion des CTC. La combinaison d’une faible teneur en oxygène avec des milieux spécialisés et des facteurs de croissance offre des conditions propices à la croissance des CTC.

Lignées cellulaires dérivées de CTC et xénogreffes

L’établissement de lignées cellulaires permanentes dérivées de CTC demeure un défi, les taux de réussite étant généralement inférieurs à 20 %, même chez les patients atteints de métastases. Lorsqu’elles sont obtenues, ces lignées cellulaires constituent des modèles renouvelables représentant la population cellulaire métastatique. Les lignées cellulaires dérivées de CTC présentent des propriétés distinctes de celles dérivées de tumeurs primaires, reflétant la sélection qui s’opère lors de la dissémination métastatique.

Les xénogreffes dérivées de CTC (CDX), générées par l’injection de CTC de patients dans des souris immunodéficientes, constituent des modèles in vivo pour l’évaluation des médicaments et l’étude des métastases. Les taux d’établissement des CDX varient selon le type de cancer et l’abondance des CTC, mais ont été obtenus pour de multiples types de tumeurs. Ces modèles conservent les caractéristiques tumorales du patient et permettent de mener des études thérapeutiques impossibles à réaliser avec un nombre limité de CTC.

Pour la recherche comparative sur le cancer, les lignées cellulaires établies constituent des modèles bien caractérisés. Les cellules A549 représentent l’adénocarcinome du poumon et permettent la comparaison avec les CTC du cancer du poumon. Les cellules MCF-7 et les CTC du cancer du sein permettent la validation de modèles de cancer du sein. Les cellules HCT116 fournissent des modèles de référence pour le cancer colorectal.

Analyse unicellulaire des CTC

Le profilage moléculaire unicellulaire permet de surmonter les défis liés à l’hétérogénéité des CTC en analysant des cellules individuelles plutôt que des populations regroupées. Le séquençage de l’ARN unicellulaire révèle la diversité transcriptomique au sein des populations de CTC, identifiant ainsi des sous-populations présentant des propriétés métastatiques ou de résistance au traitement distinctes. Cette hétérogénéité reflète à la fois la diversité intrinsèque de la tumeur et son adaptation à l’environnement circulatoire.

Le séquençage de l’ADN au niveau de la cellule unique permet d’identifier des mutations et des altérations du nombre de copies dans des CTC individuelles. La comparaison avec des échantillons de tumeurs primaires et métastatiques permet de suivre l’évolution clonale au cours de la progression de la maladie et du traitement. Les CTC peuvent héberger des mutations de résistance avant même la détection clinique d’un échec thérapeutique, ce qui permet une intervention précoce.

L’analyse unicellulaire au niveau protéique, par immunofluorescence ou cytométrie de masse, permet de caractériser les phénotypes des CTC, notamment le statut de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), les marqueurs de prolifération et l’expression des cibles thérapeutiques. Ces renseignements orientent le choix du traitement et permettent de surveiller la réponse au niveau unicellulaire.

Applications cliniques et orientations futures

Le dénombrement des CTC fournit des renseignements pronostiques pour de nombreux types de cancer. Un nombre élevé de CTC est associé à de moins bons résultats, et les variations du nombre de CTC au cours du traitement permettent de prédire la réponse. La surveillance en série des CTC permet une évaluation en temps réel de l’état de la maladie grâce à des prélèvements sanguins peu invasifs.

Les tests de sensibilité aux médicaments effectués sur des CTC multipliées ou des modèles dérivés de CTC permettent de choisir un traitement personnalisé. L’exposition ex vivo des CTC du patient à des traitements candidats permet d’identifier les traitements efficaces avant leur administration clinique. Cette approche de médecine de précision fonctionnelle complète le profilage génomique pour l’orientation thérapeutique.

L’authentification des lignées cellulaires confirme l’identité des lignées dérivées des CTC par comparaison avec des échantillons tumoraux des patients. Le dépistage des mycoplasmes garantit l’intégrité de la culture tout au long de la multiplication des CTC. Le milieu de congélation CM-1 permet la conservation des cellules dérivées des CTC en vue d’études longitudinales.

Conclusion

Les technologies d’isolement et de culture des cellules tumorales circulantes ont considérablement progressé, permettant d’accéder à cette population cellulaire rare mais cliniquement importante. De multiples plateformes d’isolement permettent de pallier la rareté et la diversité phénotypique des CTC, tandis que des conditions de culture spécialisées favorisent leur expansion en vue d’études fonctionnelles. L’analyse unicellulaire révèle l’hétérogénéité des CTC et leur évolution au cours du traitement. À mesure que les technologies continuent de s’améliorer, les CTC joueront un rôle de plus en plus important en oncologie de précision, allant du dénombrement pronostique aux tests fonctionnels de sensibilité aux médicaments guidant le choix d’un traitement personnalisé.