Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

เซลล์มะเร็งที่หมุนเวียนในกระแสเลือด: เทคนิคการแยกและโปรโตคอลการเพาะเลี้ยง

เซลล์มะเร็งที่หมุนเวียนในกระแสเลือด (CTCs) เป็นเซลล์มะเร็งที่หายากซึ่งหลุดออกมาจากก้อนมะเร็งต้นกำเนิดหรือแหล่งแพร่กระจายเข้าสู่กระแสเลือด แม้ว่าจะมีจำนวนน้อยมาก—โดยปกติมีน้อยกว่า 10 เซลล์ต่อมิลลิลิตรของเลือด ในขณะที่เซลล์เลือดปกติมีอยู่หลายพันล้านเซลล์—เซลล์เหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีค่าอย่างยิ่งเกี่ยวกับชีววิทยาของเนื้องอก กลไกการแพร่กระจาย และการตอบสนองต่อการรักษาความก้าวหน้าในเทคโนโลยีการแยกเซลล์ CTC และโปรโตคอลการเพาะเลี้ยงในปัจจุบันช่วยให้นักวิจัยสามารถจับ เก็บจำนวน และวิเคราะห์ลักษณะของเซลล์เหล่านี้ได้ เพื่อการประยุกต์ใช้ในทางมะเร็งวิทยาที่แม่นยำ ตั้งแต่การวินิจฉัยด้วยการตรวจชิ้นเนื้อเหลวไปจนถึงการทดสอบความไวต่อยาในเซลล์ที่อยู่นอกร่างกาย

ประเด็นสำคัญ

• CTCs เกิดขึ้นที่ความถี่ต่ำมากซึ่งต้องการเทคโนโลยีการเพิ่มปริมาณที่มีความไวสูงและจำเพาะเจาะจง
• วิธีการแยกใช้คุณสมบัติทางกายภาพ (ขนาด, ความหนาแน่น) หรือเครื่องหมายทางชีวภาพ (EpCAM) สำหรับการจับ CTC
• การเพาะเลี้ยง CTC ที่ประสบความสำเร็จต้องการเงื่อนไขเฉพาะที่จัดการกับความต้านทานต่อ anoikis และความท้าทายในการเพิ่มจำนวน
• เซลล์ไลน์และซีโนกราฟท์ที่ได้จาก CTC เป็นแพลตฟอร์มสำหรับการทดสอบความไวต่อยาและการศึกษาเชิงกลไก
• การวิเคราะห์เซลล์เดี่ยวของ CTCs เผยให้เห็นความหลากหลายของเนื้องอกและการวิวัฒนาการภายใต้แรงกดดันจากการรักษา

ความท้าทายของความหายากของ CTC

เซลล์มะเร็งที่หมุนเวียนในกระแสเลือดเป็นประชากรที่หายากมากในเลือดส่วนปลาย โดยปกติจะเกิดขึ้นที่ความถี่ 1-100 เซลล์ต่อ 10 มิลลิลิตรของเลือด ซึ่งประกอบด้วยเซลล์เม็ดเลือดแดงประมาณ 50 พันล้านเซลล์และเซลล์เม็ดเลือดขาวประมาณ 50 ล้านเซลล์ ความหายากนี้—ประมาณหนึ่ง CTC ต่อหนึ่งล้านถึงสิบล้านเซลล์เม็ดเลือดที่มีนิวเคลียส—ต้องการเทคโนโลยีการเพิ่มความเข้มข้นที่มีความไวและความจำเพาะสูง ซึ่งสามารถกู้คืนเหตุการณ์ที่หายากในขณะที่ลดปริมาณเซลล์เม็ดเลือดปกติในพื้นหลังที่มากมาย

ความอุดมสมบูรณ์ของ CTC มีความสัมพันธ์กับระยะของโรค โดยผู้ป่วยที่มีการแพร่กระจายของโรคมักจะมี CTC มากกว่าผู้ป่วยที่มีโรคเฉพาะที่ อย่างไรก็ตาม แม้แต่ในมะเร็งระยะลุกลาม CTC ก็ยังคงพบได้น้อย และผู้ป่วยบางรายมี CTC ไม่สามารถตรวจพบได้แม้จะมีโรคแพร่กระจายอย่างกว้างขวาง ความแปรปรวนนี้สะท้อนถึงชีววิทยาที่ซับซ้อนของการเข้าสู่กระแสเลือดของเซลล์มะเร็ง การอยู่รอดในกระแสเลือด และการออกจากกระแสเลือดไปยังตำแหน่งที่ห่างไกล

ความสำคัญทางคลินิกของ CTCs ในฐานะตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับพยากรณ์โรคและการทำนายผลได้รับการยืนยันในมะเร็งหลายชนิด การอนุมัติจาก FDA สำหรับระบบ CellSearch ในการนับจำนวน CTC ในมะเร็งเต้านม มะเร็งต่อมลูกหมาก และมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักที่แพร่กระจาย ได้ยืนยันความน่าเชื่อถือของ CTCs ในฐานะตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่มีประโยชน์ทางคลินิก การวิจัยยังคงขยายการประยุกต์ใช้จากการนับจำนวนไปสู่การจำแนกลักษณะทางโมเลกุล ซึ่งช่วยให้สามารถใช้วิธีการทางมะเร็งวิทยาที่มีความแม่นยำสูง

วิธีการแยกด้วยภูมิคุ้มกันแม่เหล็ก

ระบบ CellSearch เป็นมาตรฐานทองคำที่ได้รับการรับรองจาก FDA สำหรับแพลตฟอร์มการแยกเซลล์มะเร็งที่ไหลเวียน (CTC) วิธีนี้ใช้ลูกปัดแม่เหล็กที่จับกับแอนติบอดีต่อต้าน EpCAM (โมเลกุลยึดเกาะเซลล์เยื่อบุผิว) เพื่อจับเซลล์มะเร็งที่มาจากเยื่อบุผิว หลังจากแยกด้วยแม่เหล็กแล้ว CTC จะถูกระบุโดยการย้อมสีบวกสำหรับ cytokeratins และ DAPI โดยย้อมสีลบสำหรับเครื่องหมายเม็ดเลือดขาว CD45 ซึ่งช่วยแยกเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ปนเปื้อนออกไป

การจับยึดโดยใช้ EpCAM ช่วยเพิ่มจำนวน CTC จากมะเร็งชนิด carcinoma ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยยังคงลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์เยื่อบุผิวไว้ แต่มีโอกาสพลาด CTC ที่ผ่านกระบวนการเปลี่ยนผ่านจากเยื่อบุผิวไปเป็นเซลล์มีเซนไคม์ (EMT) และมีการลดการแสดงออกของตัวบ่งชี้เยื่อบุผิว CTC กลุ่มย่อยที่เกี่ยวข้องกับ EMT อาจมีศักยภาพในการแพร่กระจายสูงขึ้น ทำให้การตรวจพบมีความสำคัญทางคลินิก การใช้อาติบอดีจับยึดทางเลือกหรือเพิ่มเติมที่มุ่งเป้าไปยังตัวบ่งชี้มีเซนไคม์ จะช่วยขยายขอบเขตการตรวจพบ CTC ที่มีความหลากหลายทางสัณฐานวิทยา

วิธีการกำจัดแบบลบจะกำจัดเซลล์เลือดปกติแทนที่จะเลือก CTCs อย่างเฉพาะเจาะจง การกำจัดโดยใช้ CD45 จะกำจัดเม็ดเลือดขาว ทำให้สามารถกู้คืน CTCs ได้โดยไม่ขึ้นอยู่กับการแสดงออกของเครื่องหมายเยื่อบุผิว วิธีการนี้สามารถจับกลุ่ม CTCs ที่มีความหลากหลายทางฟีโนไทป์ รวมถึงเซลล์ EMT แต่ให้ระดับความบริสุทธิ์ต่ำกว่าวิธีการเลือกแบบบวก

การแยกตามขนาดและไมโครฟลูอิดิก

การแยกตามขนาดใช้ประโยชน์จากเส้นผ่านศูนย์กลางที่ใหญ่กว่าของ CTCs ส่วนใหญ่ (15-25 μm) เมื่อเทียบกับเม็ดเลือดขาว (7-15 μm)การกรองผ่านเยื่อที่มีขนาดรูพรุนที่กำหนดไว้ (โดยทั่วไปคือ 8 ไมโครเมตร) จะกักเก็บ CTCs ไว้ในขณะที่ปล่อยให้เซลล์เม็ดเลือดที่มีขนาดเล็กกว่าผ่านไปได้ วิธีการแบบไม่ติดฉลากนี้สามารถจับ CTCs ได้โดยไม่ขึ้นกับการแสดงออกของเครื่องหมายบนพื้นผิว แต่มีโอกาสสูญเสีย CTCs ที่มีขนาดเล็กกว่าหรือ CTCs ที่สามารถเปลี่ยนรูปร่างได้ซึ่งสามารถผ่านรูพรุนได้

อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกช่วยให้สามารถแยกเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดเฉพาะ (CTC) ได้อย่างซับซ้อนผ่านหลักการแยกทางกายภาพและชีวภาพที่ผสานรวมกัน CTC-iChip ผสานการเคลื่อนที่ด้านข้างแบบกำหนดทิศทางเพื่อเพิ่มความเข้มข้นตามขนาดกับการกำจัดเซลล์เม็ดเลือดขาวด้วยแม่เหล็กไฟฟ้า วิธีการคัดเลือกเชิงลบนี้สามารถกู้คืนเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดเฉพาะที่มีชีวิตอยู่ได้โดยไม่ต้องติดฉลากด้วยแอนติบอดี ซึ่งอาจรบกวนการเพาะเลี้ยงหรือการวิเคราะห์ในขั้นตอนต่อไป

แพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกที่ผสานแอนติบอดีต่อต้าน EpCAM บนพื้นผิวชิปสามารถดักจับเซลล์มะเร็งที่ไหลเวียนในกระแสเลือด (CTCs) ภายใต้สภาวะการไหลที่ควบคุมได้ อุปกรณ์เหล่านี้มีประสิทธิภาพการดักจับสูง พร้อมทั้งสามารถผสานกับการวิเคราะห์ขั้นต่อไปได้ เช่น การย้อมสีภูมิคุ้มกันบนชิปหรือการปล่อยเซลล์เพื่อการเพาะเลี้ยง การออกแบบไมโครฟลูอิดิกแบบขนานช่วยเพิ่มปริมาณงานสำหรับการประยุกต์ใช้ทางคลินิก

ระเบียบปฏิบัติทางวัฒนธรรมของ CTC

วัฒนธรรมของเซลล์มะเร็งที่หมุนเวียน (CTC) นำเสนอความท้าทายที่สำคัญนอกเหนือจากความหายากของพวกมัน เซลล์มะเร็งที่หมุนเวียนต้องรอดชีวิตจากการแยกตัวออกจากเมทริกซ์ของเนื้องอกหลัก การเข้าสู่หลอดเลือด ความเครียดจากการไหลเวียนของเลือด และการโจมตีของระบบภูมิคุ้มกัน—ซึ่งคัดเลือกเซลล์ที่มีคุณสมบัติการอยู่รอดที่โดดเด่น เซลล์ที่รอดชีวิตเหล่านี้มักยังคงอยู่ในภาวะสงบหรือมีแนวโน้มที่จะเกิดการตายแบบอะพอพโทซิสในสภาวะการเพาะเลี้ยงมาตรฐานที่ปรับให้เหมาะสมกับสายพันธุ์เซลล์ที่ก่อตัวแล้ว

สภาวะการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะต่ำมากช่วยส่งเสริมการอยู่รอดของเซลล์เม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด (CTC) โดยการป้องกันการตายแบบอะโนอิคิส (การตายของเซลล์ที่เกิดจากการหลุดออกจากพื้นผิว) การเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยในสื่อที่มีสเต็มเซลล์ซึ่งมี EGF, FGF และอินซูลินช่วยสนับสนุนการเพิ่มจำนวนของ CTC ในขณะที่ยังคงรักษาคุณสมบัติในการเริ่มต้นเนื้องอก การเพาะเลี้ยงแบบสามมิติในสภาวะเหล่านี้ช่วยเพิ่มจำนวนเซลล์ที่มีคุณสมบัติคล้ายสเต็มเซลล์

การเพาะเลี้ยงในสภาวะขาดออกซิเจน (1-5% O₂) ช่วยเพิ่มการอยู่รอดและการเพิ่มจำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิด CTC เมื่อเทียบกับการเพาะเลี้ยงในอากาศปกติ การขาดออกซิเจนช่วยรักษาคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิดและลดความเครียดออกซิเดชันที่อาจจำกัดการขยายตัวของ CTC การผสมผสานระหว่างออกซิเจนต่ำกับอาหารเลี้ยงเชื้อเฉพาะและปัจจัยการเจริญเติบโตจะสร้างสภาวะที่เอื้อต่อการเจริญเติบโตของ CTC

เซลล์ไลน์และซีโนกราฟต์ที่ได้จาก CTC

การก่อตั้งเซลล์ไลน์ถาวรที่ได้จาก CTC อย่างประสบความสำเร็จยังคงเป็นความท้าทาย โดยมีอัตราความสำเร็จต่ำกว่า 20% แม้จะมาจากผู้ป่วยระยะแพร่กระจาย เมื่อประสบความสำเร็จแล้ว เซลล์ไลน์เหล่านี้จะเป็นแบบจำลองที่สามารถนำมาใช้ใหม่ได้ซึ่งเป็นตัวแทนของประชากรเซลล์ที่แพร่กระจาย เซลล์ไลน์ที่ได้จาก CTC แสดงคุณสมบัติที่แตกต่างจากเซลล์ไลน์ที่ได้จากเนื้องอกปฐมภูมิ สะท้อนถึงการคัดเลือกที่เกิดขึ้นระหว่างการแพร่กระจายไปยังอวัยวะอื่น

การปลูกถ่ายเซลล์จากสิ่งมีชีวิตต่างสายพันธุ์ที่ได้จากเซลล์เม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด (CTC-derived xenografts หรือ CDX) ที่สร้างขึ้นโดยการฉีด CTC จากผู้ป่วยเข้าสู่หนูที่ขาดภูมิคุ้มกัน เป็นแบบจำลองในร่างกายจริงสำหรับการทดสอบยาและการศึกษาการแพร่กระจายของมะเร็ง อัตราการสร้าง CDX แตกต่างกันไปตามชนิดของมะเร็งและความเข้มข้นของ CTC แต่สามารถทำได้ในมะเร็งหลายชนิด แบบจำลองเหล่านี้คงลักษณะของเนื้องอกจากผู้ป่วยและเอื้อต่อการศึกษาการรักษาที่ไม่สามารถทำได้เมื่อมีจำนวน CTC จำกัด

สำหรับการวิจัยมะเร็งเชิงเปรียบเทียบ สายเซลล์ที่สร้างขึ้นแล้วให้แบบจำลองที่มีลักษณะเฉพาะอย่างดีเซลล์ A549เป็นตัวแทนของมะเร็งปอดชนิดอะดีโนคาร์ซิโนมาสำหรับการเปรียบเทียบกับเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ไหลเวียนในกระแสเลือด (CTCs) ของมะเร็งปอดเซลล์ MCF-7และ CTCs ของมะเร็งเต้านมช่วยให้การตรวจสอบความถูกต้องของแบบจำลองมะเร็งเต้านมเซลล์ HCT116ให้แบบจำลองอ้างอิงสำหรับมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก

การวิเคราะห์เซลล์เดี่ยวของเซลล์เม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด

การวิเคราะห์โมเลกุลระดับเซลล์เดี่ยวสามารถเอาชนะความท้าทายของความหลากหลายของเซลล์เม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด (CTC) ได้โดยการวิเคราะห์เซลล์แต่ละเซลล์แทนที่จะเป็นกลุ่มเซลล์ที่รวมกัน การหาลำดับ RNA ของเซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นความหลากหลายของทรานสคริปโตมภายในประชากร CTC ซึ่งสามารถระบุกลุ่มย่อยที่มีคุณสมบัติการแพร่กระจายหรือต้านทานการรักษาที่แตกต่างกันได้ ความหลากหลายนี้สะท้อนถึงความหลากหลายของเนื้องอกโดยธรรมชาติและการปรับตัวต่อสภาพแวดล้อมในระบบไหลเวียนโลหิต

การหาลำดับดีเอ็นเอระดับเซลล์เดี่ยวสามารถระบุการกลายพันธุ์และการเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนาของยีนในเซลล์มะเร็งที่ไหลเวียนในกระแสเลือด (CTCs) แต่ละเซลล์ได้ การเปรียบเทียบกับตัวอย่างเนื้องอกต้นกำเนิดและเนื้องอกที่แพร่กระจายช่วยให้ติดตามวิวัฒนาการของโคลนระหว่างการพัฒนาของโรคและการรักษา CTCs อาจมีกลายพันธุ์ที่ทำให้ดื้อต่อยาได้ก่อนที่จะตรวจพบความล้มเหลวของการรักษาทางคลินิก ทำให้สามารถแทรกแซงได้ตั้งแต่ระยะเริ่มต้น

การวิเคราะห์ระดับโปรตีนของเซลล์เดี่ยวโดยใช้เทคนิคอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์หรือแมสไซโตเมทรีช่วยจำแนกลักษณะของ CTC รวมถึงสถานะ EMT, ตัวบ่งชี้การเพิ่มจำนวนเซลล์ และการแสดงออกของเป้าหมายยา ข้อมูลนี้ช่วยในการเลือกวิธีการรักษาและติดตามการตอบสนองในระดับเซลล์เดี่ยว

การประยุกต์ใช้ทางคลินิกและทิศทางในอนาคต

การนับจำนวนเซลล์มะเร็งในกระแสเลือด (CTC) ให้ข้อมูลพยากรณ์โรคในมะเร็งหลายชนิด การนับจำนวน CTC ที่สูงขึ้นสัมพันธ์กับผลลัพธ์ที่แย่ลง และการเปลี่ยนแปลงของจำนวน CTC ระหว่างการรักษาสามารถทำนายการตอบสนองต่อการรักษาได้ การติดตาม CTC อย่างต่อเนื่องช่วยให้ประเมินสถานะของโรคแบบเรียลไทม์ผ่านการเจาะเลือดเพียงเล็กน้อย

การทดสอบความไวต่อยาบนเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ขยายตัว (CTCs) หรือแบบจำลองที่ได้จาก CTCs ช่วยให้สามารถเลือกการรักษาที่เหมาะสมกับผู้ป่วยแต่ละรายได้ การสัมผัสกับยาหรือการรักษาที่เป็นตัวเลือกในสภาพแวดล้อมภายนอกร่างกาย (ex vivo) ของ CTCs จากผู้ป่วยจะช่วยให้สามารถระบุการรักษาที่มีประสิทธิภาพได้ก่อนการให้ยาทางคลินิก วิธีการแพทย์แม่นยำเชิงหน้าที่นี้ช่วยเสริมการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมเพื่อให้คำแนะนำในการรักษา

การยืนยันสายพันธุ์เซลล์ยืนยันตัวตนของสายพันธุ์เซลล์ที่ได้จาก CTC ผ่านการเปรียบเทียบกับตัวอย่างเนื้องอกของผู้ป่วยการทดสอบไมโคพลาสมาช่วยให้มั่นใจในความสมบูรณ์ของการเพาะเลี้ยงตลอดการขยายตัวของ CTCสารละลายแช่แข็ง CM-1ช่วยให้สามารถเก็บรักษาเซลล์ที่ได้จาก CTC สำหรับการศึกษาในระยะยาว

สรุป

เทคโนโลยีการแยกและเพาะเลี้ยงเซลล์มะเร็งที่หมุนเวียนในกระแสเลือดได้พัฒนาไปอย่างมาก ทำให้สามารถเข้าถึงประชากรเซลล์ที่หายากแต่มีความสำคัญทางคลินิกนี้ได้ แพลตฟอร์มการแยกหลายรูปแบบช่วยแก้ไขปัญหาความหายากและความหลากหลายทางฟีโนไทป์ของ CTC ในขณะที่สภาวะการเพาะเลี้ยงเฉพาะทางช่วยสนับสนุนการขยายตัวของ CTC สำหรับการศึกษาเชิงหน้าที่ การวิเคราะห์ระดับเซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นความหลากหลายและความเปลี่ยนแปลงของ CTC ระหว่างการรักษา เมื่อเทคโนโลยีมีการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง CTC จะมีบทบาทที่ขยายตัวมากขึ้นในด้านมะเร็งวิทยาแบบแม่นยำ ตั้งแต่การนับจำนวนเพื่อพยากรณ์โรคไปจนถึงการทดสอบความไวต่อยาเชิงหน้าที่เพื่อช่วยในการเลือกการรักษาเฉพาะบุคคล