วิธีการผลิตเวกเตอร์เลนติไวรัสโดยใช้เซลล์ HEK293T

วิธีการผลิตเวกเตอร์เลนทิไวรัสโดยใช้เซลล์ HEK293T

เวกเตอร์เลนติไวรัลได้กลายเป็นเครื่องมือที่จำเป็นในชีววิทยาโมเลกุลสมัยใหม่ การบำบัดด้วยยีน และวิศวกรรมเซลล์ ที่ Cytion เราได้ปรับแต่งโปรโตคอลสำหรับการผลิตเวกเตอร์เลนติไวรัลที่มีปริมาณสูงโดยใช้เซลล์ HEK293T คุณภาพพรีเมียมของเรา ซึ่งได้รับการออกแบบมาโดยเฉพาะสำหรับการถ่ายโอนยีนที่มีประสิทธิภาพและการผลิตไวรัส คู่มือฉบับสมบูรณ์นี้จะนำคุณผ่านโปรโตคอลที่พิสูจน์แล้วของเราสำหรับการสร้างเวกเตอร์เลนติไวรัลคุณภาพสูงสำหรับความต้องการในการวิจัยของคุณ

พารามิเตอร์	คำแนะนำ
สายเซลล์ที่เหมาะสมที่สุด	เซลล์ HEK293T(ผ่านเพาะเลี้ยง 5-20 ครั้งเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด)
การรวมตัวของเซลล์ที่การถ่ายโอนยีน	70-80%
วิธีการทรานส์เฟคชัน	การถ่ายโอนยีนด้วยแคลเซียมฟอสเฟตหรือ PEI
กรอบเวลาการเก็บรวบรวมข้อมูลเวกเตอร์	การเก็บเกี่ยวครั้งแรก: 48 ชั่วโมงหลังการถ่ายโอนยีน การเก็บเกี่ยวครั้งที่สอง: 72 ชั่วโมงหลังการถ่ายโอนยีน
ช่วงความเข้มข้นที่คาดหวัง	106-108TU/mL (ไม่เข้มข้น)

บทนำเกี่ยวกับเวกเตอร์เลนติไวรัสและเซลล์ HEK293T

เวกเตอร์เลนทิไวรัสซึ่งมีต้นกำเนิดจาก HIV-1 มีข้อได้เปรียบหลายประการสำหรับการนำยีนเข้าสู่เซลล์ รวมถึงความสามารถในการรวมตัวเข้ากับเซลล์ที่กำลังแบ่งตัวและเซลล์ที่ไม่แบ่งตัว การแสดงออกที่ยาวนานและมีความเสถียรสูง รวมถึงความสามารถในการบรรจุยีนที่ค่อนข้างมาก การผลิตเวกเตอร์เหล่านี้ต้องพึ่งพาเซลล์ HEK293T เป็นอย่างมากเนื่องจากเซลล์ชนิดนี้สามารถแสดงออกของแอนติเจน SV40 large T ซึ่งเอื้อให้เกิดการจำลองแบบแบบอีพิโซมของพลาสมิดที่มีแหล่งกำเนิดการจำลองแบบ SV40สำหรับการผลิตไวรัสที่ดีที่สุด เราแนะนำให้ใช้เซลล์ HEK293Tในช่วงการผ่านรุ่นที่ 5-20 เนื่องจากเซลล์ที่อยู่นอกช่วงนี้อาจแสดงประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนที่ลดลงและปริมาณไวรัสที่ได้ลดลง

การรวมตัวของเซลล์: ปัจจัยสำคัญสำหรับความสำเร็จของการถ่ายโอนยีน

การบรรลุความหนาแน่นของเซลล์ที่ถูกต้องในเวลาของการถ่ายยีนเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการผลิตไวรัสเลนติไวรัสที่ประสบความสำเร็จ เราพบอย่างต่อเนื่องว่าเซลล์ HEK293Tควรมีความหนาแน่นอยู่ที่ 70-80% ของความหนาแน่นเต็มที่เมื่อทำการถ่ายยีน ที่ความหนาแน่นนี้ เซลล์อยู่ในระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิทึม ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายยีนและการผลิตไวรัสในขั้นตอนต่อไปให้ดีที่สุดการรวมตัวกันของเซลล์ในระดับต่ำอาจส่งผลให้ผลผลิตไม่เหมาะสม ในขณะที่การรวมตัวกันของเซลล์มากเกินไปมักนำไปสู่สุขภาพของเซลล์ที่ลดลง ประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนที่ลดลง และระดับไวรัสที่ต่ำลง สำหรับจานเพาะเลี้ยงขนาดมาตรฐาน 10 ซม. เราแนะนำให้เพาะเซลล์ 5-6 × 10⁶ เซลล์ 24 ชั่วโมงก่อนการถ่ายโอนยีนเพื่อให้ได้ความหนาแน่นที่เหมาะสมนี้

การเลือกวิธีการทรานส์เฟคชั่นที่เหมาะสม

สำหรับการนำพลาสมิดไวรัสเลนติไวรัสเข้าสู่เซลล์ HEK293T เราขอแนะนำให้ใช้วิธีตกตะกอนด้วยแคลเซียมฟอสเฟตหรือวิธีทรานส์เฟคชันด้วยพอลิเอทิลีนอิไมน์ (PEI) ทั้งสองวิธีนี้ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีประสิทธิภาพสูงในห้องปฏิบัติการของเรา โดยวิธีแคลเซียมฟอสเฟตเป็นวิธีดั้งเดิมที่นิยมใช้ ส่วน PEI เป็นทางเลือกที่คุ้มค่ากว่าโดยไม่ลดประสิทธิภาพ วิธีแคลเซียมฟอสเฟตโดดเด่นด้วยผลกระทบที่อ่อนโยนต่อความมีชีวิตของเซลล์ ในขณะที่ PEI มักให้อัตราการทรานส์เฟคชันที่สูงกว่าเล็กน้อยในประสบการณ์ของเราสำหรับผู้ใช้ครั้งแรก เราแนะนำให้เริ่มต้นด้วยวิธี PEI ที่อัตราส่วน DNA:PEI 1:3 เนื่องจากวิธีนี้มีความยืดหยุ่นต่อความแปรปรวนของเทคนิคมากกว่า ในขณะที่ยังคงให้ผลผลิตไวรัสที่ยอดเยี่ยม

เวลาที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเก็บตัวอย่างเวกเตอร์

ระยะเวลาในการเก็บรวบรวมเวกเตอร์ไวรัสเลนทิวิรัสมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อทั้งปริมาณและคุณภาพ การทดสอบอย่างกว้างขวางของเราด้วยเซลล์ HEK293Tแสดงให้เห็นว่าการเก็บเกี่ยวแบบสองครั้งช่วยเพิ่มการผลิตไวรัสให้สูงสุด เราแนะนำให้ทำการเก็บเกี่ยวครั้งแรกที่ 48 ชั่วโมงหลังจากการถ่ายโอนยีน เมื่อการผลิตไวรัสได้ถึงระดับที่มีนัยสำคัญแต่ก่อนที่การตายของเซลล์จะเกิดขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากเก็บและเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์อย่างระมัดระวังแล้ว การเก็บเกี่ยวครั้งที่สองที่ 72 ชั่วโมงหลังการถ่ายโอนยีนจะจับอนุภาคไวรัสเพิ่มเติมที่ผลิตขึ้นในช่วงเวลานี้ กลยุทธ์การเก็บเกี่ยวแบบต่อเนื่องนี้โดยทั่วไปจะเพิ่มผลผลิตรวมได้ 30-50% เมื่อเทียบกับการเก็บเพียงครั้งเดียว โดยไม่ส่งผลกระทบต่อคุณภาพของเวกเตอร์ สำหรับการใช้งานที่ต้องการความรวดเร็ว การเก็บเกี่ยวที่ 48 ชั่วโมงเพียงอย่างเดียวก็มักจะให้ค่าความเข้มข้นของไวรัสที่เพียงพอสำหรับความต้องการในการทดลองส่วนใหญ่

ช่วงความเข้มข้นที่คาดหวังและการเพิ่มประสิทธิภาพผลผลิต

ตามโปรโตคอลที่ได้รับการปรับปรุงของเรา การเตรียมเชื้อไวรัสเลนทิไวรัสแบบไม่เข้มข้นโดยทั่วไปจะให้ค่าความเข้มข้นของเชื้อไวรัส (titers) อยู่ระหว่าง^{10^6}ถึง^{10^8}หน่วยการถ่ายโอน (transducing units) ต่อมิลลิลิตร (TU/mL) ขึ้นอยู่กับเวกเตอร์การถ่ายโอนที่เฉพาะเจาะจงและชนิดของเซลล์เป้าหมายสำหรับการใช้งานที่ต้องการความเข้มข้นสูงขึ้น การปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วสูงพิเศษหรือการตกตะกอนด้วย PEG สามารถเพิ่มค่าไทเทอร์ได้ 100-1000 เท่า เพื่อเพิ่มผลผลิตสูงสุด เราแนะนำให้เติมโซเดียมบิวทิเรต (10 มิลลิโมลาร์) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อหลังจากการทรานส์เฟคชัน ซึ่งสามารถเพิ่มการผลิตไวรัสโดยการยับยั้งฮิสโตนดีอะซิทิลเลสและส่งเสริมการถอดรหัสจากโปรโมเตอร์ของไวรัสนอกจากนี้ การลดอุณหภูมิการบ่มลงเหลือ 32-34°C ในระหว่างขั้นตอนการเก็บเกี่ยวสามารถเพิ่มผลผลิตได้มากขึ้นโดยการชะลอการเสื่อมสภาพของไวรัสในขณะที่ยังคงรักษาการผลิตไว้ได้ ด้วยการปรับปรุงเหล่านี้เซลล์ HEK293Tของเราสามารถผลิตสารเตรียมไวรัสคุณภาพสูงได้อย่างสม่ำเสมอ เหมาะสำหรับการใช้งานที่ต้องการมากที่สุด