Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Kiertävät kasvainsolut: Solujen eristämistekniikat ja viljelyprotokollat: eristystekniikat ja viljelyprotokollat

Kiertävät kasvainsolut (Circulating Tumor Cell, CTC) ovat harvinaisia syöpäsoluja, jotka erittyvät primaarikasvaimista tai etäpesäkkeistä verenkiertoon. Huolimatta niiden vähäisyydestä - tyypillisesti alle 10 CTC-solua millilitrassa verta miljardien normaalien verisolujen joukossa - nämä solut tarjoavat korvaamatonta tietoa kasvaimen biologiasta, etäpesäkemekanismeista ja hoitovasteesta. CTC-eristystekniikoiden ja -viljelyprotokollien kehittymisen ansiosta tutkijat voivat nyt kaapata, luetella ja luonnehtia näitä soluja tarkkuus-onkologian sovelluksia varten, jotka ulottuvat nestebiopsiadiagnostiikasta ex vivo-lääkeherkkyystesteihin.

Keskeiset asiat

• CTC-soluja esiintyy äärimmäisen harvoin, mikä edellyttää erittäin herkkiä ja spesifisiä rikastustekniikoita
• Eristysmenetelmissä hyödynnetään fysikaalisia ominaisuuksia (koko, tiheys) tai biologisia merkkiaineita (EpCAM) CTC:n talteenottoon
• Onnistunut CTC-viljely edellyttää erityisolosuhteita, joissa käsitellään anoikisresistenssin ja proliferaation haasteita
• CTC:stä johdetut solulinjat ja ksenotransplantaatit tarjoavat alustan lääkeherkkyyden testaamiseen ja mekanistisiin tutkimuksiin
• CTC:iden yksisoluinen analyysi paljastaa kasvaimen heterogeenisuuden ja evoluution hoitopaineen alla

CTC:n harvinaisuuden haaste

Verenkierrossa olevat kasvainsolut ovat erittäin harvinainen populaatio perifeerisessä veressä, sillä niitä esiintyy tyypillisesti 1-100 solua 10 millilitrassa verta, jossa on noin 50 miljardia punasolua ja 50 miljoonaa valkosolua. Tämä harvinaisuus - noin yksi CTC miljoonasta kymmeneen miljoonaan ydinsolua kohti - edellyttää erittäin herkkiä ja spesifisiä rikastustekniikoita, joilla harvinaiset tapahtumat voidaan ottaa talteen samalla kun normaalien verisolujen valtava tausta tyhjennetään.

CTC:n runsaus korreloi taudin vaiheen kanssa, ja etäpesäkkeitä sairastavilla potilailla on tyypillisesti enemmän CTC:tä kuin potilailla, joilla on paikallinen tauti. Jopa pitkälle edenneessä syövässä CTC:t ovat kuitenkin harvinaisia, ja joillakin potilailla CTC:t eivät ole havaittavissa laajasta metastaattisesta taudista huolimatta. Tämä vaihtelevuus kuvastaa kasvainsolujen sisäisen invasiivisuuden, verenkierrossa selviytymisen ja kaukokulkeutumisen monimutkaista biologiaa.

CTC:iden kliininen merkitys ennuste- ja ennustebiomarkkereina on todettu useissa eri syöpätyypeissä. FDA:n hyväksyntä CellSearch-järjestelmälle CTC-laskennan suorittamiseksi metastaattisessa rinta-, eturauhas- ja paksusuolen syövässä vahvisti CTC:t kliinisesti hyödyllisiksi biomarkkereiksi. Tutkimus jatkuu, ja sovelluksia laajennetaan laskennasta molekyylitason karakterisointiin, mikä mahdollistaa tarkkuus-onkologiset lähestymistavat.

Immunomagneettiset eristysmenetelmät

CellSearch-järjestelmä on FDA:n hyväksymä kultainen standardi CTC-eristysalusta. Menetelmässä käytetään immunomagneettisia helmiä, jotka on konjugoitu anti-EpCAM (epiteelisolujen adheesiomolekyyli) -vasta-aineisiin epiteelisoluista peräisin olevien kasvainsolujen talteenottoon. Magneettierotuksen jälkeen CTC:t tunnistetaan sytokeratiinien ja DAPI:n positiivisen värjäytymisen perusteella, ja leukosyyttien merkkiaineen CD45 negatiivinen värjäytyminen sulkee pois kontaminoituneet valkosolut.

EpCAM-pohjainen talteenotto rikastuttaa tehokkaasti CTC:t karsinoomista, joiden epiteelifenotyyppi säilyy, mutta saattaa jättää huomiotta CTC:t, jotka ovat läpikäyneet epiteeli-mesenkymaalisen siirtymän (EMT) ja joiden epiteelimerkkiaineet ovat vähentyneet. EMT-assosioituneilla CTC-alipopulaatioilla voi olla lisääntynyt metastaattinen potentiaali, minkä vuoksi niiden havaitseminen on kliinisesti tärkeää. Vaihtoehtoiset tai ylimääräiset mesenkymimerkkiaineisiin kohdistuvat sieppausvasta-aineet laajentavat fenotyyppisesti erilaisten CTC:iden havaitsemista.

Negatiiviset poistomenetelmät poistavat normaaleja verisoluja sen sijaan, että ne valitsisivat CTC:t positiivisesti. CD45-pohjainen depletio poistaa leukosyytit, mikä mahdollistaa CTC:iden talteenoton epiteelimarkkereiden ilmentymisestä riippumatta. Tämä lähestymistapa kattaa fenotyyppisesti monimuotoiset CTC-populaatiot, mukaan lukien EMT-solut, mutta sen puhtaus on alhaisempi kuin positiivisen valinnan menetelmien.

Kokoon perustuva ja mikrofluidinen eristäminen

Kokoon perustuvassa erottelussa hyödynnetään useimpien CTC-solujen suurempaa halkaisijaa (15-25 μm) verrattuna leukosyytteihin (7-15 μm). Suodatus kalvojen läpi, joiden huokoskoko on määritelty (tyypillisesti 8 μm), pitää CTC:t talteen ja päästää pienemmät verisolut läpi. Tämä leimaton menetelmä vangitsee CTC:t pintamarkkerien ilmentymisestä riippumatta, mutta saattaa menettää pienempiä CTC:itä tai CTC:itä, jotka ovat muodonmuutoskykyisiä ja voivat kulkea huokosten läpi.

Mikrofluidiset laitteet mahdollistavat hienostuneen CTC-eristyksen integroitujen fysikaalisten ja biologisten erotusperiaatteiden avulla. CTC-iChipissä yhdistyvät deterministinen lateraalinen siirtyminen kokoon perustuvaa rikastamista varten ja leukosyyttien immunomagneettinen poisto. Tämä negatiivisen valinnan lähestymistapa palauttaa elinkelpoiset CTC:t ilman vasta-ainemerkintöjä, jotka saattavat häiritä jatkokäsittelyn jälkeistä viljelyä tai analysointia.

Mikrofluidiset alustat, jotka sisältävät anti-EpCAM-vasta-aineita sirujen pinnoilla, keräävät CTC:t kontrolloiduissa virtausolosuhteissa. Näillä laitteilla saavutetaan korkea sieppaustehokkuus ja mahdollistetaan samalla integrointi jatkoanalyyseihin, mukaan lukien sirulla tapahtuva immunovärjäys tai solujen vapauttaminen viljelyä varten. Rinnakkaistetut mikrofluidiset mallit lisäävät läpimenoa kliinisissä sovelluksissa.

CTC-viljelyprotokollat

CTC-viljelyyn liittyy merkittäviä haasteita niiden harvinaisuuden lisäksi. Verenkierrossa olevien kasvainsolujen on selviydyttävä primäärisestä kasvainmatriisista irtoamisesta, intravasaatiosta, verenkierron leikkausrasituksesta ja immuunihyökkäyksestä, jolloin valitaan soluja, joilla on erilaiset selviytymisominaisuudet. Nämä eloonjääneet solut pysyvät usein rauhallisina tai alttiina apoptoosille vakiintuneille solulinjoille optimoiduissa vakioviljelyolosuhteissa.

Erittäin alhaisen kiinnittymisen viljelyolosuhteet edistävät CTC:n selviytymistä estämällä anoikis (irtoamisen aiheuttama apoptoosi). EGF-, FGF- ja insuliinia sisältävässä kantasoluviljelmässä suspensioviljely tukee CTC:n lisääntymistä säilyttäen samalla kasvainten käynnistysominaisuudet. Kolmiulotteinen sferoidiviljely näissä olosuhteissa rikastuttaa soluja, joilla on kantasolujen kaltaisia ominaisuuksia.

Hypoksinen viljely (1-5 % O₂) parantaa CTC:n selviytymistä ja lisääntymistä verrattuna ilmakehän happipitoisuuteen. Hypoksia ylläpitää kantasolujen ominaisuuksia ja vähentää oksidatiivista stressiä, joka saattaa rajoittaa CTC:n laajenemista. Alhaisen hapen yhdistäminen erikoistuneisiin väliaineisiin ja kasvutekijöihin luo olosuhteet, jotka suosivat CTC:n kasvua.

CTC-peräiset solulinjat ja vierasperäiset siirteet

Pysyvien CTC:stä peräisin olevien solulinjojen onnistunut perustaminen on edelleen haastavaa, sillä onnistumisprosentti on yleensä alle 20 % jopa metastaattisista potilaista. Kun nämä solulinjat saadaan aikaan, ne tarjoavat uusiutuvia malleja, jotka edustavat metastaattista solupopulaatiota. CTC:stä peräisin olevilla solulinjoilla on ominaisuuksia, jotka eroavat primaarista kasvaimesta peräisin olevista linjoista, mikä heijastaa metastaattisen leviämisen aikana tapahtuvaa valikoitumista.

CTC:stä peräisin olevat ksenotransplantaatit (CDX), jotka on tuotettu ruiskuttamalla potilaan CTC:tä immuunipuutteisiin hiiriin, tarjoavat in vivo -malleja lääkkeiden testaukseen ja metastaasitutkimuksiin. CDX:n muodostumisaste vaihtelee syöpätyypin ja CTC:n runsauden mukaan, mutta sitä on saatu aikaan useissa eri kasvaintyypeissä. Nämä mallit säilyttävät potilaan kasvaimen ominaisuudet ja mahdollistavat terapeuttiset tutkimukset, jotka eivät ole mahdollisia rajoitetuilla CTC-määrillä.

Vertailevassa syöpätutkimuksessa vakiintuneet solulinjat tarjoavat hyvin karakterisoituja malleja. A549-solut edustavat keuhkojen adenokarsinoomaa, jota voidaan verrata keuhkosyövän CTC:iin. MCF-7-solut ja rintasyövän CTC:t mahdollistavat rintasyöpämallien validoinnin. HCT116-solut tarjoavat paksu- ja peräsuolisyövän vertailumalleja.

CTC:iden yhden solun analyysi

Yksisoluisella molekyyliprofiloinnilla ratkaistaan CTC:n heterogeenisuuteen liittyvät haasteet analysoimalla yksittäisiä soluja yhdistettyjen populaatioiden sijasta. Yksisoluinen RNA-sekvensointi paljastaa transkriptomista monimuotoisuutta CTC-populaatioiden sisällä ja tunnistaa osapopulaatioita, joilla on erilaisia metastaattisia tai hoitoresistenttejä ominaisuuksia. Tämä heterogeenisuus heijastaa sekä kasvaimen sisäistä monimuotoisuutta että sopeutumista verenkiertoympäristöön.

Yhden solun DNA-sekvensoinnilla tunnistetaan mutaatioita ja kopiolukumuutoksia yksittäisissä CTC:issä. Vertailu primaarisiin ja metastaattisiin kasvainnäytteisiin seuraa kloonien kehitystä taudin etenemisen ja hoidon aikana. CTC:t voivat sisältää resistenssimutaatioita ennen hoidon epäonnistumisen kliinistä havaitsemista, mikä mahdollistaa varhaisen puuttumisen.

Yksittäisten solujen proteiinitason analyysi immunofluoresenssin tai massasytometrian avulla luonnehtii CTC:n fenotyyppejä, mukaan lukien EMT-status, proliferaatiomarkkerit ja lääkekohteiden ilmentyminen. Nämä tiedot ohjaavat hoidon valintaa ja valvovat hoitovastetta yksittäisen solun tasolla.

Kliiniset sovellukset ja tulevaisuuden suuntaviivat

CTC-luokitus antaa ennustetietoa useista eri syöpätyypeistä. Suuremmat CTC-lukumäärät korreloivat huonompien tulosten kanssa, ja CTC-lukumäärän muutokset hoidon aikana ennustavat hoitovastetta. CTC:n sarjaseuranta mahdollistaa taudin tilan reaaliaikaisen arvioinnin minimaalisesti invasiivisten verinäytteiden avulla.

Lääkeherkkyyden testaus laajennetuilla CTC:llä tai CTC:stä johdetuilla malleilla mahdollistaa yksilöllisen hoidon valinnan. Potilaiden CTC:iden altistaminen hoitokandidaateille ex vivo tunnistaa tehokkaat hoidot ennen kliinistä käyttöä. Tämä funktionaalinen täsmälääketieteen lähestymistapa täydentää genomista profilointia hoidon ohjauksessa.

Solulinjojen autentikointi vahvistaa CTC-solulinjan identiteetin vertaamalla sitä potilaan kasvainnäytteisiin. Mykoplasmatestaus varmistaa kulttuurin eheyden koko CTC-laajentumisen ajan. Freeze Medium CM-1 mahdollistaa CTC-solujen tallentamisen pitkittäistutkimuksia varten.

Päätelmät

Kiertävien kasvainsolujen eristys- ja viljelytekniikat ovat kehittyneet merkittävästi, mikä mahdollistaa tämän harvinaisen mutta kliinisesti tärkeän solupopulaation käytön. Useat eristysalustat vastaavat CTC:n harvinaisuuteen ja fenotyyppiseen monimuotoisuuteen, ja erikoistuneet viljelyolosuhteet tukevat CTC:n laajentamista toiminnallisia tutkimuksia varten. Yksisoluanalyysit paljastavat CTC:iden heterogeenisuuden ja niiden kehittymisen hoidon aikana. Teknologian kehittyessä edelleen CTC:t ovat yhä tärkeämmässä roolissa tarkkuusonkologiassa, joka ulottuu ennusteiden määrittämisestä funktionaaliseen lääkeherkkyyden testaukseen, joka ohjaa yksilöllisen hoidon valintaa.