Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

循环肿瘤细胞：分离技术和培养方案

循环肿瘤细胞（CTC）是从原发肿瘤或转移部位脱落到血液中的罕见癌细胞。尽管它们数量稀少--在数十亿正常血细胞中，每毫升血液中通常只有不到 10 个 CTC，但这些细胞为了解肿瘤生物学、转移机制和治疗反应提供了宝贵的信息。现在，CTC 分离技术和培养方案的进步使研究人员能够捕获、计数和表征这些细胞，用于从液体活检诊断到体内外药物敏感性测试等精准肿瘤学应用。

主要启示

• CTC 的出现频率极低，需要高灵敏度和特异性的富集技术
• 利用物理特性（大小、密度）或生物标记（EpCAM）捕获 CTC 的分离方法
• 成功的 CTC 培养需要专门的条件，以应对耐 anoikis 和增殖方面的挑战
• CTC 衍生的细胞系和异种移植为药物敏感性测试和机理研究提供了平台
• CTC 的单细胞分析揭示了治疗压力下的肿瘤异质性和演变

CTC 罕见性的挑战

循环肿瘤细胞是外周血中极为罕见的细胞群，通常在每 10 毫升血液（含约 500 亿个红细胞和 5000 万个白细胞）中出现 1-100 个细胞。这种稀有性--大约每一百万到一千万个有核血细胞中才有一个 CTC--要求高灵敏度和特异性的富集技术，既能回收稀有细胞，又能清除大量正常血细胞。

CTC 的丰度与疾病分期有关，转移性患者通常比局部疾病患者携带更多的 CTC。不过，即使在晚期癌症患者中，CTC 仍然很少见，有些患者虽然有广泛的转移性疾病，但却检测不到 CTC。这种变化反映了肿瘤细胞内侵、在循环中存活以及向远处外渗的复杂生物学特性。

CTC 作为预后和预测生物标志物的临床意义已在多种癌症类型中得到证实。用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌 CTC计数的 CellSearch 系统获得了美国食品及药物管理局（FDA）的批准，证实了 CTC 是临床上有用的生物标记物。研究还在继续，应用范围从计数扩展到分子特征描述，从而实现精准肿瘤学方法。

免疫磁分离方法

CellSearch 系统是经 FDA 认证的黄金标准 CTC 分离平台。这种方法使用与抗 EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体结合的免疫磁珠来捕获上皮来源的肿瘤细胞。磁性分离后，通过细胞角蛋白和 DAPI 的阳性染色鉴定 CTC，而白细胞标记物 CD45 的阴性染色则可排除污染的白细胞。

基于 EpCAM 的捕获可有效富集保持上皮表型的癌细胞中的 CTC，但可能会漏掉发生上皮-间质转化（EMT）和上皮标志物下调的 CTC。与 EMT 相关的 CTC 亚群可能具有更强的转移潜力，因此对它们的检测具有重要的临床意义。针对间充质标记物的替代或额外捕获抗体可扩大表型多样化 CTC 的检测范围。

阴性耗竭法可去除正常血细胞，而不是阳性选择 CTC。基于 CD45 的耗竭法能去除白细胞，从而恢复不依赖于上皮标记表达的 CTC。这种方法能捕获表型多样的 CTC 群体，包括 EMT 细胞，但纯度低于阳性选择方法。

基于尺寸和微流体的分离

与白细胞（7-15 μm）相比，大多数 CTC 的直径较大（15-25 μm），因此基于尺寸的分离方法可利用这一特点。通过具有确定孔径（通常为 8 微米）的膜过滤，可保留 CTC，同时允许较小的血细胞通过。这种无标记方法可捕获 CTC，无论其表面标记表达如何，但可能会丢失较小的 CTC 或可变形通过孔隙的 CTC。

微流控设备通过综合物理和生物分离原理实现了复杂的 CTC 分离。CTC-iChip 将确定性横向位移进行大小富集与免疫磁性去白细胞相结合。这种负选择方法能回收有活力的 CTC，而不会产生可能干扰下游培养或分析的抗体标记。

芯片表面含有抗 EpCAM 抗体的微流控平台可在受控流条件下捕获 CTC。这些设备在实现高捕获效率的同时，还能整合下游分析，包括芯片免疫染色或细胞释放培养。并行微流体设计提高了临床应用的通量。

CTC 培养方案

除了稀有性，CTC 培养还面临重大挑战。循环肿瘤细胞必须在脱离原发肿瘤基质、体内浸润、循环剪切应力和免疫攻击等情况下存活下来，这就需要选择具有独特存活特性的细胞。在为已建立的细胞系优化的标准培养条件下，这些存活下来的细胞往往处于静止或易凋亡状态。

超低附着培养条件可防止anoikis（脱落诱导的细胞凋亡），从而促进四氯化碳的存活。在含有表皮生长因子、表皮生长因子和胰岛素的干细胞培养基中进行悬浮培养，可支持 CTC 增殖，同时保持肿瘤诱发特性。在这些条件下进行的三维球形培养可富集具有干样特性的细胞。

与常压氧相比，低氧培养（1-5% O₂）可提高 CTC 的存活率和增殖率。低氧能保持干细胞特性，减少可能限制CTC扩增的氧化应激。低氧与专用培养基和生长因子相结合，可提供有利于 CTC 生长的条件。

CTC 衍生细胞系和异种移植

成功建立永久性 CTC 衍生细胞系仍具有挑战性，即使是来自转移性患者的成功率通常也低于 20%。一旦成功，这些细胞系就能提供代表转移细胞群的可再生模型。CTC 衍生细胞系具有不同于原发肿瘤衍生细胞系的特性，反映了转移传播过程中的选择。

将患者的 CTC 注入免疫缺陷小鼠体内产生的 CTC 衍生异种移植物（CDX）为药物测试和转移研究提供了体内模型。CDX 的建立率因癌症类型和 CTC 丰度而异，但已在多种肿瘤类型中实现。这些模型保持了患者肿瘤的特征，可以进行治疗研究，而有限的 CTC 数量则无法实现。

对于癌症比较研究，已建立的细胞系可提供特性良好的模型。A549 细胞代表肺腺癌，可与肺癌 CTC 进行比较。MCF-7 细胞和乳腺癌 CTC 可用于乳腺癌模型验证。HCT116 细胞提供结直肠癌参考模型。

CTC 的单细胞分析

单细胞分子图谱分析通过分析单个细胞而不是集合细胞群，克服了 CTC 异质性带来的挑战。单细胞 RNA 测序揭示了 CTC 群体中转录组的多样性，确定了具有不同转移或耐药特性的亚群。这种异质性反映了肿瘤的内在多样性和对循环环境的适应性。

单细胞 DNA 测序可确定单个 CTC 中的突变和拷贝数改变。与原发性和转移性肿瘤样本进行比较，可追踪疾病进展和治疗过程中的克隆演变。在临床检测到治疗失败之前，CTCs 就可能携带抗药性突变，从而实现早期干预。

利用免疫荧光或质控细胞仪进行的蛋白质级单细胞分析可确定 CTC 表型的特征，包括 EMT 状态、增殖标记物和药物靶点表达。这些信息可指导治疗选择并监测单细胞水平的反应。

临床应用和未来方向

CTC计数可提供多种癌症类型的预后信息。较高的 CTC 数量与较差的预后相关，治疗过程中 CTC 数量的变化可预测反应。连续的 CTC 监测可通过微创抽血对疾病状态进行实时评估。

对扩增的 CTC 或 CTC 衍生模型进行药物敏感性测试可实现个性化治疗选择。将患者的 CTC 与候选疗法进行体内外暴露，可在临床用药前确定有效的治疗方法。这种功能性精准医疗方法是对基因组分析的补充，可为治疗提供指导。

细胞系鉴定通过与患者肿瘤样本对比，确认 CTC 衍生细胞系的身份。支原体检测可确保 CTC 扩增过程中培养基的完整性。冷冻培养基 CM-1可将 CTC 衍生细胞储存起来，用于纵向研究。

结论

循环肿瘤细胞分离和培养技术已取得重大进展，使人们能够获得这种罕见但在临床上非常重要的细胞群。多种分离平台可解决 CTC 的稀有性和表型多样性问题，而专门的培养条件则可支持用于功能研究的 CTC 扩增。单细胞分析揭示了 CTC 的异质性及其在治疗过程中的演变。随着技术的不断改进，CTC 将在精准肿瘤学中发挥越来越大的作用，从预后枚举到指导个性化治疗选择的功能性药物敏感性测试。