Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Tsirkuleerivad kasvajarakud: Isolatsioonitehnikad ja kultuuriprotokollid

Tsirkuleerivad kasvajarakud (CTC) kujutavad endast haruldasi vähirakke, mis eralduvad primaarsetest kasvajatest või metastaatilistest kohtadest vereringesse. Hoolimata nende vähesusest - tavaliselt on neid vähem kui 10 CTC-d ühe milliliitri vere kohta miljardite normaalsete vererakkude hulgas - annavad need rakud hindamatut teavet kasvaja bioloogia, metastaatiliste mehhanismide ja ravivastuse kohta. CTC-de isoleerimistehnoloogiate ja kultuuriprotokollide areng võimaldab nüüd teadlastel neid rakke koguda, loendada ja iseloomustada täpsete onkoloogiliste rakenduste jaoks, mis ulatuvad vedelate biopsia diagnostikast kuni ex vivo ravimitundlikkuse testimiseni.

Peamised järeldused

• CTC-d esinevad äärmiselt väikese sagedusega, mis nõuab väga tundlikke ja spetsiifilisi rikastamistehnoloogiaid
• Isolatsioonimeetodid kasutavad füüsikalisi omadusi (suurus, tihedus) või bioloogilisi markereid (EpCAM) CTCde püüdmiseks
• Edukas CTC-kultuur nõuab spetsiaalseid tingimusi, mis on suunatud anoikisresistentsuse ja proliferatsiooniprobleemide lahendamisele
• CTC-st saadud rakuliinid ja ksenotransplantaadid pakuvad platvormi ravimitundlikkuse testimiseks ja mehaanilisteks uuringuteks
• CTC-de üksikrakuline analüüs näitab kasvaja heterogeensust ja arengut ravisurve all

CTC harulduse väljakutse

Tsirkuleerivad kasvajarakud on perifeerses veres äärmiselt haruldane populatsioon, mida esineb tavaliselt 1-100 rakku 10 ml vere kohta, mis sisaldab ligikaudu 50 miljardit punast vererakku ja 50 miljonit valgeliblestikku. Selline haruldus - ligikaudu üks CTC miljoni kuni kümne miljoni tuumaraku kohta - nõuab väga tundlikke ja spetsiifilisi rikastamistehnoloogiaid, mis suudavad harvaesinevad sündmused kätte saada ja samal ajal vähendada normaalsete vererakkude suurt hulka.

CTC-de arvukus on seotud haiguse staadiumiga, kusjuures metastaatilistel patsientidel on tavaliselt rohkem CTC-sid kui lokaalse haigusega patsientidel. Kuid isegi kaugelearenenud vähi korral on CTC-d haruldased ja mõnel patsiendil on CTC-d vaatamata ulatuslikule metastaatilisele haigusele avastamata. Selline varieeruvus peegeldab kasvajarakkude intravasiivse leviku, tsirkulatsioonis ellujäämise ja kaugemate paikmete ekstravasatsiooni keerukat bioloogiat.

CTCde kliiniline tähtsus prognostiliste ja prognoosivate biomarkeritena on kindlaks tehtud mitmete vähitüüpide puhul. CTCde loendamise süsteemi CellSearch FDA heakskiitmine metastaatilise rinna-, eesnäärme- ja kolorektaalvähi puhul kinnitas CTCde kui kliiniliselt kasulike biomarkerite olemasolu. Teadusuuringud jätkuvad, laiendades rakendusi loendamisest molekulaarse iseloomustamiseni, mis võimaldab täpset onkoloogilist lähenemist.

Immunomagnetilised isoleerimismeetodid

Süsteem CellSearch on kuldstandardiks FDA poolt heakskiidetud CTC-de isoleerimise platvorm. Selles meetodis kasutatakse epiteelirakkude adhesiomolekuli (epiteeli adhesioonimolekul) antikehadega konjugeeritud immunomagnetilisi helmekesi, et püüda epiteelist pärinevaid kasvajarakke. Pärast magnetilist eraldamist tuvastatakse CTCd tsütokeratiinide ja DAPI positiivse värvimise abil, kusjuures leukotsüütide markeri CD45 negatiivne värvimine välistab saastunud valgelibled.

EpCAM-põhine püüdmine rikastab tõhusalt CTC-d epiteliaalset fenotüüpi säilitavatest kartsinoomidest, kuid võib jätta kõrvale CTC-d, mis on läbinud epiteliaalse-mesenhümaalse ülemineku (EMT) ja mille epiteliaalsed markerid on alla reguleeritud. EMT-assotsieerunud CTC alampopulatsioonidel võib olla suurem metastaatiline potentsiaal, mistõttu nende avastamine on kliiniliselt oluline. Alternatiivsed või täiendavad mesenhüümimarkeritele suunatud antikehad laiendavad fenotüübiliselt mitmekesiste CTCde avastamist.

Negatiivsed depletsioonimeetodid eemaldavad pigem normaalseid vererakke kui positiivselt selekteerivad CTCsid. CD45-põhine depletsioon eemaldab leukotsüüdid, võimaldades CTCde taastamist epiteeli markerite ekspressioonist sõltumatult. See lähenemisviis hõlmab fenotüübiliselt mitmekesiseid CTC-populatsioone, sealhulgas EMT-rakke, kuid tagab väiksema puhtuse kui positiivse selektsiooni meetodid.

Suurusel põhinev ja mikrofluidiline isoleerimine

Suurusel põhinev eraldamine kasutab ära enamiku CTCde suuremat läbimõõtu (15-25 μm) võrreldes leukotsüütidega (7-15 μm). Filtreerimine läbi membraanide, mille poorid on määratletud suurusega (tavaliselt 8 μm), hoiab CTCd tagasi, lastes samas väiksemad vererakud läbi. Selline märgistamisvaba lähenemisviis püüab CTCd sõltumata pinna markerite ekspressioonist, kuid võib kaotada väiksemaid CTCsid või CTCsid, mille deformeeruvus võimaldab läbida poore.

Mikrofluidilised seadmed võimaldavad keerukat CTC-de isoleerimist integreeritud füüsikaliste ja bioloogiliste eraldamispõhimõtete abil. CTC-iChip ühendab deterministliku külgsuunalise nihkumise suurusepõhise rikastamise ja leukotsüütide immunomagnetilise eemaldamise. Selline negatiivse selektsiooni lähenemisviis taastab elujõulised CTCd ilma antikehade märgistamiseta, mis võib häirida järgnevat kultuuri või analüüsi.

Mikrofluidilised platvormid, mis sisaldavad anti-EpCAM-vastaseid antikehi kiibi pinnal, püüavad CTCsid kontrollitud voolutingimustes. Need seadmed saavutavad suure püüdmise tõhususe, võimaldades samal ajal integreerida järgnevat analüüsi, sealhulgas kiibil toimuvat immunovärvimist või rakkude vabastamist kultiveerimiseks. Paralleelsed mikrofluidilised disainilahendused suurendavad kliiniliste rakenduste läbilaskevõimet.

CTC-kultuuri protokollid

CTC-kultuuriga kaasnevad märkimisväärsed probleemid lisaks nende haruldusele. Tsirkuleerivad kasvajarakud peavad üle elama esmase kasvaja maatriksist eraldumise, intravasatsiooni, tsirkulatsioonilise lõikestressi ja immuunsüsteemi rünnaku, mis valib välja rakud, millel on erilised ellujäämisomadused. Need ellujääjad jäävad sageli rahulikuks või apoptoosile vastuvõtlikuks standardkultuuritingimustes, mis on optimeeritud väljakujunenud rakuliinide jaoks.

Ülimadalate kinnituste kultuuritingimused soodustavad CTCde ellujäämist, vältides anoikis (eraldumisest põhjustatud apoptoos). Suspensionikultuur tüvirakkude keskkonnas, mis sisaldab EGF-i, FGF-i ja insuliini, toetab CTC-de proliferatsiooni, säilitades samal ajal kasvajate tekkepõhised omadused. Kolmemõõtmeline sferoidikultuur nendes tingimustes rikastab tüveliste omadustega rakke.

Hüpoksiline kultuur (1-5% O₂) parandab CTCde ellujäämist ja proliferatsiooni võrreldes atmosfääri hapnikuga. Hüpoksia säilitab tüvirakkude omadused ja vähendab oksüdatiivset stressi, mis võib piirata CTC laienemist. Madala hapniku sisalduse kombineerimine spetsiaalsete keskkondade ja kasvufaktoritega loob tingimused, mis soosivad CTCde väljakasvu.

CTC-st saadud rakuliinid ja ksenotransplantaadid

Püsivate CTC-st saadud rakuliinide edukas loomine on endiselt keeruline, sest isegi metastaatiliste patsientide puhul on edukuse määr tavaliselt alla 20%. Kui need rakuliinid on saavutatud, pakuvad need metastaatiliste rakkude populatsiooni taastuvaid mudeleid. CTCdest saadud rakuliinidel on omadusi, mis erinevad primaarsetest kasvajatest saadud liinidest, mis peegeldavad selektsiooni metastaatilise leviku ajal.

CTCdest saadud ksenotransplantaadid (CDX), mis on loodud patsiendi CTCde süstimisega immuunpuudulikku hiirtesse, pakuvad in vivo mudeleid ravimite testimiseks ja metastaaside uuringuteks. CDXi tekkimise määrad varieeruvad sõltuvalt vähitüübist ja CTCde arvukusest, kuid seda on saavutatud mitmete kasvajatüüpide puhul. Need mudelid säilitavad patsiendi kasvaja omadused ja võimaldavad terapeutilisi uuringuid, mis ei ole võimalikud piiratud CTC-de arvuga.

Võrdlevateks vähiuuringuteks pakuvad väljakujunenud rakuliinid hästi iseloomustatud mudeleid. A549 rakud esindavad kopsu adenokartsinoomi, mida saab võrrelda kopsuvähi CTCdega. MCF-7 rakud ja rinnavähi CTCd võimaldavad rinnavähi mudelite valideerimist. HCT116 rakud pakuvad kolorektaalvähi võrdlusmudeleid.

CTC-de üksikraku analüüs

Ühe raku molekulaarse profiili koostamine võimaldab lahendada CTC-de heterogeensusega seotud probleeme, analüüsides pigem üksikuid rakke kui koondatud populatsioone. Üksikraku RNA sekveneerimine näitab transkriptoomilist mitmekesisust CTC-populatsioonides, tuvastades metastaatiliste või raviresistentsete omadustega alampopulatsioonid. Selline heterogeensus peegeldab nii kasvajate sisemist mitmekesisust kui ka kohanemist vereringekeskkonnaga.

Ühe raku DNA sekveneerimine tuvastab mutatsioonid ja koopiaarvu muutused üksikutes CTC-des. Võrreldes primaarse ja metastaatilise kasvaja proovidega jälgitakse kloonide arengut haiguse progresseerumise ja ravi ajal. CTCd võivad sisaldada resistentsuse mutatsioone enne ravi ebaõnnestumise kliinilist avastamist, mis võimaldab varajast sekkumist.

Üksikute rakkude valgutasandi analüüs immunofluorestsentsuse või masstsütomeetria abil iseloomustab CTC fenotüüpe, sealhulgas EMT-staatust, proliferatsioonimarkereid ja ravimite sihtmärkide ekspressiooni. See teave suunab ravi valikut ja jälgib ravivastust ühe raku tasandil.

Kliinilised rakendused ja tulevased suundumused

CTCde loendamine annab prognostilist teavet mitmete vähitüüpide kohta. Suurem CTC-de arv korreleerub halvemate tulemustega ning CTC-de arvu muutused ravi ajal ennustavad ravivastust. CTC seeriaviisiline jälgimine võimaldab haiguse seisundi hindamist reaalajas minimaalselt invasiivsete vereproovide abil.

Ravimitundlikkuse testimine laiendatud CTC-de või CTC-dest tuletatud mudelitega võimaldab individuaalset ravivalikut. Patsientide CTC-de eks vivo kokkupuude kandidaatravimitega võimaldab tuvastada tõhusad ravimeetodid enne kliinilist manustamist. See funktsionaalne täppismeditsiini lähenemisviis täiendab genoomilist profiili ravi suunamiseks.

Rakuliinide autentimine kinnitab CTC-st saadud rakuliinide identiteeti, võrreldes neid patsiendi kasvajaproovidega. Mükoplasma testimine tagab kultuuri terviklikkuse kogu CTC ekspansiooni jooksul. Freeze Medium CM-1 võimaldab CTC-st saadud rakkude säilitamist pikaajaliste uuringute jaoks.

Kokkuvõte

Tsirkuleerivate kasvajarakkude isoleerimise ja kasvatamise tehnoloogiad on oluliselt edasi arenenud, võimaldades juurdepääsu sellele haruldasele, kuid kliiniliselt olulisele rakupopulatsioonile. Mitmesugused isoleerimisplatvormid tegelevad CTC harulduse ja fenotüübilise mitmekesisusega, samal ajal kui spetsiaalsed kasvatustingimused toetavad CTC laiendamist funktsionaalsete uuringute jaoks. Üksikraku analüüs näitab CTCde heterogeensust ja nende arengut ravi ajal. Kuna tehnoloogia täiustub jätkuvalt, on CTC-del üha suurem roll täppisonkoloogias, alates prognostilisest loendusest kuni funktsionaalse ravimitundlikkuse testimiseni, mis suunab isikupärastatud ravi valikut.