Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα: Καλλιέργεια κυτταρικών κυττάρων: Τεχνικές απομόνωσης και πρωτόκολλα καλλιέργειας

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTCs) αντιπροσωπεύουν σπάνια καρκινικά κύτταρα που αποβάλλονται από πρωτογενείς όγκους ή μεταστατικές περιοχές στην κυκλοφορία του αίματος. Παρά τη σπανιότητά τους - τυπικά λιγότερα από 10 CTCs ανά χιλιοστόλιτρο αίματος ανάμεσα σε δισεκατομμύρια φυσιολογικά κύτταρα του αίματος - τα κύτταρα αυτά παρέχουν ανεκτίμητες πληροφορίες για τη βιολογία του όγκου, τους μεταστατικούς μηχανισμούς και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Οι εξελίξεις στις τεχνολογίες απομόνωσης CTC και στα πρωτόκολλα καλλιέργειας επιτρέπουν πλέον στους ερευνητές να συλλαμβάνουν, να απαριθμούν και να χαρακτηρίζουν αυτά τα κύτταρα για ογκολογικές εφαρμογές ακριβείας που κυμαίνονται από διαγνωστικές εξετάσεις υγρής βιοψίας έως δοκιμές ευαισθησίας σε φάρμακα ex vivo.

Βασικά συμπεράσματα

• Τα CTCs εμφανίζονται σε εξαιρετικά χαμηλές συχνότητες που απαιτούν εξαιρετικά ευαίσθητες και ειδικές τεχνολογίες εμπλουτισμού
• Οι μέθοδοι απομόνωσης εκμεταλλεύονται φυσικές ιδιότητες (μέγεθος, πυκνότητα) ή βιολογικούς δείκτες (EpCAM) για τη σύλληψη CTC
• Η επιτυχής καλλιέργεια των CTC απαιτεί εξειδικευμένες συνθήκες που αντιμετωπίζουν τις προκλήσεις της αντοχής στην ανοϊκή δράση και του πολλαπλασιασμού
• Οι κυτταρικές σειρές και τα ξενομοσχεύματα που προέρχονται από CTC παρέχουν πλατφόρμες για δοκιμές ευαισθησίας στα φάρμακα και μηχανιστικές μελέτες
• Η μονοκυτταρική ανάλυση των CTCs αποκαλύπτει την ετερογένεια του όγκου και την εξέλιξη υπό πίεση θεραπείας

Η πρόκληση της σπανιότητας του CTC

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν έναν εξαιρετικά σπάνιο πληθυσμό στο περιφερικό αίμα, ο οποίος συνήθως εμφανίζεται με συχνότητα 1-100 κύτταρα ανά 10 ml αίματος που περιέχει περίπου 50 δισεκατομμύρια ερυθρά αιμοσφαίρια και 50 εκατομμύρια λευκά αιμοσφαίρια. Αυτή η σπανιότητα - περίπου ένα CTC ανά εκατομμύριο έως δέκα εκατομμύρια πυρηνοκυτταρικά κύτταρα του αίματος - απαιτεί εξαιρετικά ευαίσθητες και ειδικές τεχνολογίες εμπλουτισμού, ικανές να ανακτούν σπάνια γεγονότα, εξαντλώντας παράλληλα το τεράστιο υπόβαθρο των φυσιολογικών κυττάρων του αίματος.

Η αφθονία των CTC συσχετίζεται με το στάδιο της νόσου, με τους μεταστατικούς ασθενείς να φιλοξενούν συνήθως περισσότερους CTC από εκείνους με εντοπισμένη νόσο. Ωστόσο, ακόμη και στον προχωρημένο καρκίνο, οι CTC παραμένουν σπάνιοι και ορισμένοι ασθενείς έχουν μη ανιχνεύσιμα CTC παρά την εκτεταμένη μεταστατική νόσο. Αυτή η ποικιλομορφία αντανακλά την πολύπλοκη βιολογία της ενδοδιείσδυσης των καρκινικών κυττάρων, της επιβίωσης στην κυκλοφορία και της εξωδιείσδυσης σε απομακρυσμένες περιοχές.

Η κλινική σημασία των CTCs ως προγνωστικών και προβλεπτικών βιοδεικτών έχει διαπιστωθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου. Η έγκριση από τον FDA του συστήματος CellSearch για την απαρίθμηση CTC σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού, του προστάτη και του παχέος εντέρου επικύρωσε τα CTC ως κλινικά χρήσιμους βιοδείκτες. Η έρευνα συνεχίζεται επεκτείνοντας τις εφαρμογές από την απαρίθμηση στον μοριακό χαρακτηρισμό που επιτρέπει ογκολογικές προσεγγίσεις ακριβείας.

Μέθοδοι ανοσομαγνητικής απομόνωσης

Το σύστημα CellSearch αποτελεί το χρυσό πρότυπο πλατφόρμας απομόνωσης CTC που έχει εγκριθεί από τον FDA. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί ανοσομαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα με αντισώματα anti-EpCAM (μόριο προσκόλλησης επιθηλιακών κυττάρων) για τη σύλληψη καρκινικών κυττάρων επιθηλιακής προέλευσης. Μετά τον μαγνητικό διαχωρισμό, τα CTC ταυτοποιούνται με θετική χρώση για κυτταροκερατίνες και DAPI, ενώ η αρνητική χρώση για τον δείκτη λευκοκυττάρων CD45 αποκλείει τα μολυσματικά λευκά αιμοσφαίρια.

Η σύλληψη με βάση την EpCAM εμπλουτίζει αποτελεσματικά τα CTCs από καρκινώματα που διατηρούν επιθηλιακούς φαινότυπους, αλλά μπορεί να χάσει τα CTCs που έχουν υποστεί επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT) και έχουν μειώσει τους επιθηλιακούς δείκτες. Οι υποπληθυσμοί CTC που σχετίζονται με την EMT μπορεί να διαθέτουν αυξημένο μεταστατικό δυναμικό, καθιστώντας την ανίχνευσή τους κλινικά σημαντική. Τα εναλλακτικά ή πρόσθετα αντισώματα σύλληψης που στοχεύουν σε μεσεγχυματικούς δείκτες διευρύνουν την ανίχνευση φαινοτυπικά διαφορετικών CTCs.

Οι προσεγγίσεις αρνητικής απομάκρυνσης απομακρύνουν τα φυσιολογικά κύτταρα του αίματος αντί να επιλέγουν θετικά τα CTCs. Η απομάκρυνση με βάση το CD45 απομακρύνει τα λευκοκύτταρα, επιτρέποντας την ανάκτηση των CTCs ανεξάρτητα από την έκφραση επιθηλιακών δεικτών. Αυτή η προσέγγιση συλλαμβάνει φαινοτυπικά ποικίλους πληθυσμούς CTC, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων EMT, αλλά παρέχει χαμηλότερη καθαρότητα από τις μεθόδους θετικής επιλογής.

Απομόνωση με βάση το μέγεθος και μικρορευστότητα

Ο διαχωρισμός με βάση το μέγεθος εκμεταλλεύεται τη μεγαλύτερη διάμετρο των περισσότερων CTCs (15-25 μm) σε σύγκριση με τα λευκοκύτταρα (7-15 μm). Η διήθηση μέσω μεμβρανών με καθορισμένα μεγέθη πόρων (συνήθως 8 μm) συγκρατεί τους CTC ενώ επιτρέπει τη διέλευση μικρότερων αιμοσφαιρίων. Αυτή η προσέγγιση χωρίς ετικέτες συλλαμβάνει CTCs ανεξάρτητα από την έκφραση των επιφανειακών δεικτών, αλλά μπορεί να χάσει μικρότερα CTCs ή CTCs με παραμορφωσιμότητα που επιτρέπει τη διέλευση από τους πόρους.

Οι μικρορευστομηχανές επιτρέπουν την εξελιγμένη απομόνωση CTC μέσω ολοκληρωμένων φυσικών και βιολογικών αρχών διαχωρισμού. Το CTC-iChip συνδυάζει ντετερμινιστική πλευρική μετατόπιση για εμπλουτισμό με βάση το μέγεθος με ανοσομαγνητική απομάκρυνση των λευκοκυττάρων. Αυτή η προσέγγιση αρνητικής επιλογής ανακτά βιώσιμα CTCs χωρίς σήμανση αντισωμάτων που θα μπορούσε να παρεμβαίνει στη μετέπειτα καλλιέργεια ή ανάλυση.

Οι μικρορευστικές πλατφόρμες που ενσωματώνουν αντισώματα anti-EpCAM στις επιφάνειες των τσιπ συλλαμβάνουν CTCs υπό συνθήκες ελεγχόμενης ροής. Αυτές οι συσκευές επιτυγχάνουν υψηλή απόδοση σύλληψης, ενώ παράλληλα επιτρέπουν την ενσωμάτωση με την ανάλυση που ακολουθεί, συμπεριλαμβανομένης της ανοσοχρωματισμού στο τσιπ ή της απελευθέρωσης κυττάρων για καλλιέργεια. Τα παραλληλισμένα μικρορευστολογικά σχέδια αυξάνουν την απόδοση για κλινικές εφαρμογές.

Πρωτόκολλα καλλιέργειας CTC

Η καλλιέργεια CTC παρουσιάζει σημαντικές προκλήσεις πέρα από τη σπανιότητά τους. Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα πρέπει να επιβιώσουν από την αποκόλληση από την πρωτογενή μήτρα του όγκου, την ενδοδιείσδυση, την κυκλοφοριακή διατμητική πίεση και την ανοσολογική επίθεση - επιλέγοντας κύτταρα με ξεχωριστές ιδιότητες επιβίωσης. Αυτοί οι επιζώντες συχνά παραμένουν σε ηρεμία ή είναι επιρρεπείς στην απόπτωση σε τυπικές συνθήκες καλλιέργειας που βελτιστοποιούνται για καθιερωμένες κυτταρικές σειρές.

Οι συνθήκες καλλιέργειας με εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση προάγουν την επιβίωση των CTC αποτρέποντας την αναοικείωση (απόπτωση που προκαλείται από την αποκόλληση). Η καλλιέργεια εναιωρήματος σε μέσα βλαστικών κυττάρων που περιέχουν EGF, FGF και ινσουλίνη υποστηρίζει τον πολλαπλασιασμό των CTC, διατηρώντας παράλληλα τις ιδιότητες έναρξης όγκου. Η τρισδιάστατη καλλιέργεια σφαιροειδών σε αυτές τις συνθήκες εμπλουτίζει τα κύτταρα με βλαστικές ιδιότητες.

Η υποξική καλλιέργεια (1-5% O₂) βελτιώνει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των CTC σε σύγκριση με το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Η υποξία διατηρεί τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων και μειώνει το οξειδωτικό στρες που μπορεί να περιορίσει την επέκταση των CTC. Ο συνδυασμός χαμηλού οξυγόνου με εξειδικευμένα μέσα και αυξητικούς παράγοντες παρέχει συνθήκες που ευνοούν την ανάπτυξη των CTC.

Κυτταρικές γραμμές και ξενομοσχεύματα που προέρχονται από CTC

Η επιτυχής δημιουργία μόνιμων κυτταρικών σειρών προερχόμενων από CTC παραμένει πρόκληση, με ποσοστά επιτυχίας συνήθως κάτω του 20% ακόμη και από μεταστατικούς ασθενείς. Όταν επιτευχθεί, αυτές οι κυτταρικές σειρές παρέχουν ανανεώσιμα μοντέλα που αντιπροσωπεύουν τον μεταστατικό κυτταρικό πληθυσμό. Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από CTC παρουσιάζουν ιδιότητες διαφορετικές από τις σειρές που προέρχονται από πρωτογενή όγκο, αντανακλώντας την επιλογή κατά τη μεταστατική διάδοση.

Τα ξενομοσχεύματα προερχόμενα από CTC (CDX) που παράγονται με την έγχυση CTCs ασθενών σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια παρέχουν in vivo μοντέλα για δοκιμές φαρμάκων και μελέτες μετάστασης. Τα ποσοστά δημιουργίας CDX ποικίλλουν ανάλογα με τον τύπο καρκίνου και την αφθονία των CTC, αλλά έχουν επιτευχθεί σε πολλούς τύπους όγκων. Αυτά τα μοντέλα διατηρούν τα χαρακτηριστικά του όγκου του ασθενούς και επιτρέπουν θεραπευτικές μελέτες που δεν είναι δυνατές με περιορισμένο αριθμό CTC.

Για τη συγκριτική έρευνα του καρκίνου, οι καθιερωμένες κυτταρικές σειρές παρέχουν καλά χαρακτηρισμένα μοντέλα. Τα κύτταρα A549 αντιπροσωπεύουν το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα για σύγκριση με τα CTCs του καρκίνου του πνεύμονα. Τα κύτταρα MCF-7 και οι CTCs του καρκίνου του μαστού επιτρέπουν την επικύρωση μοντέλων καρκίνου του μαστού. Τα κύτταρα HCT116 παρέχουν μοντέλα αναφοράς για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Ανάλυση μεμονωμένων κυττάρων CTCs

Η μοριακή σκιαγράφηση μονού κυττάρου ξεπερνά τις προκλήσεις της ετερογένειας των CTC με την ανάλυση μεμονωμένων κυττάρων και όχι συγκεντρωτικών πληθυσμών. Η αλληλουχία RNA ενός κυττάρου αποκαλύπτει τη μεταγραφική ποικιλομορφία εντός των πληθυσμών CTC, προσδιορίζοντας υποπληθυσμούς με διακριτές ιδιότητες μεταστατικότητας ή ανθεκτικότητας στη θεραπεία. Αυτή η ετερογένεια αντανακλά τόσο την εγγενή ποικιλομορφία του όγκου όσο και την προσαρμογή στο περιβάλλον της κυκλοφορίας.

Η αλληλούχιση DNA ενός κυττάρου προσδιορίζει μεταλλάξεις και αλλοιώσεις του αριθμού αντιγράφων σε μεμονωμένα CTCs. Η σύγκριση με δείγματα πρωτοπαθών και μεταστατικών όγκων παρακολουθεί την εξέλιξη των κλώνων κατά την εξέλιξη της νόσου και τη θεραπεία. Οι CTCs μπορεί να κρύβουν μεταλλάξεις αντοχής πριν από την κλινική ανίχνευση της αποτυχίας της θεραπείας, επιτρέποντας την έγκαιρη παρέμβαση.

Η ανάλυση μεμονωμένων κυττάρων σε επίπεδο πρωτεϊνών με χρήση ανοσοφθορισμού ή κυτταρομετρίας μάζας χαρακτηρίζει τους φαινότυπους των CTC, συμπεριλαμβανομένης της κατάστασης EMT, των δεικτών πολλαπλασιασμού και της έκφρασης στόχων φαρμάκων. Οι πληροφορίες αυτές καθοδηγούν την επιλογή της θεραπείας και παρακολουθούν την ανταπόκριση σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου.

Κλινικές εφαρμογές και μελλοντικές κατευθύνσεις

Η απαρίθμηση των CTC παρέχει προγνωστικές πληροφορίες σε πολλούς τύπους καρκίνου. Οι υψηλότεροι αριθμοί CTC συσχετίζονται με χειρότερη έκβαση και οι αλλαγές στον αριθμό των CTC κατά τη διάρκεια της θεραπείας προβλέπουν την ανταπόκριση. Η σειριακή παρακολούθηση των CTC παρέχει αξιολόγηση της κατάστασης της νόσου σε πραγματικό χρόνο μέσω ελάχιστα επεμβατικών αιμοληψιών.

Η δοκιμή ευαισθησίας στα φάρμακα σε διευρυμένα CTC ή σε μοντέλα που προέρχονται από CTC επιτρέπει την εξατομικευμένη επιλογή θεραπείας. Η Ex vivo έκθεση των CTCs ασθενών σε υποψήφιες θεραπείες προσδιορίζει αποτελεσματικές θεραπείες πριν από την κλινική χορήγηση. Αυτή η λειτουργική προσέγγιση της ιατρικής ακριβείας συμπληρώνει το γονιδιωματικό προφίλ για την καθοδήγηση της θεραπείας.

Η πιστοποίηση κυτταρικής σειράς επιβεβαιώνει την ταυτότητα της κυτταρικής σειράς που προέρχεται από CTC μέσω σύγκρισης με δείγματα όγκων ασθενών. Η δοκιμή μυκοπλάσματος διασφαλίζει την ακεραιότητα της καλλιέργειας καθ' όλη τη διάρκεια της επέκτασης των CTC. Το μέσο κατάψυξης CM-1 επιτρέπει την αποθήκευση κυττάρων που προέρχονται από CTC για διαχρονικές μελέτες.

Συμπέρασμα

Οι τεχνολογίες απομόνωσης και καλλιέργειας κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων έχουν εξελιχθεί σημαντικά, επιτρέποντας την πρόσβαση σε αυτόν τον σπάνιο αλλά κλινικά σημαντικό κυτταρικό πληθυσμό. Οι πολλαπλές πλατφόρμες απομόνωσης αντιμετωπίζουν τη σπανιότητα και τη φαινοτυπική ποικιλομορφία των CTC, ενώ οι εξειδικευμένες συνθήκες καλλιέργειας υποστηρίζουν την επέκταση των CTC για λειτουργικές μελέτες. Η μονοκυτταρική ανάλυση αποκαλύπτει την ετερογένεια των CTC και την εξέλιξή τους κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Καθώς οι τεχνολογίες συνεχίζουν να βελτιώνονται, οι CTCs θα διαδραματίσουν όλο και μεγαλύτερο ρόλο στην ογκολογία ακριβείας, από την προγνωστική καταμέτρηση έως τη λειτουργική δοκιμή ευαισθησίας στα φάρμακα, καθοδηγώντας την εξατομικευμένη επιλογή θεραπείας.