Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Циркулиращи туморни клетки: Техники за изолиране и протоколи за култивиране

Циркулиращите туморни клетки (ЦТК) представляват редки ракови клетки, които се изхвърлят от първични тумори или метастатични участъци в кръвния поток. Въпреки тяхната рядкост - обикновено по-малко от 10 CTCs на милилитър кръв сред милиарди нормални кръвни клетки - тези клетки предоставят безценни данни за туморната биология, механизмите на метастазиране и отговора на лечението. Напредъкът в технологиите за изолиране на ЦТК и протоколите за култивиране вече позволява на изследователите да улавят, изброяват и характеризират тези клетки за приложения в прецизната онкология, вариращи от диагностика чрез течна биопсия до ex vivo тестване на чувствителността към лекарства.

Основни изводи

• КТК се срещат с изключително ниска честота, което изисква високочувствителни и специфични технологии за обогатяване
• Методите за изолиране използват физични свойства (размер, плътност) или биологични маркери (EpCAM) за улавяне на CTC
• Успешното култивиране на ЦТК изисква специализирани условия, насочени към резистентност към аноикис и предизвикателства, свързани с пролиферацията
• Клетъчните линии, получени от ЦТК, и ксенографтите осигуряват платформи за изпитване на чувствителността към лекарства и механични изследвания
• Едноклетъчният анализ на CTCs разкрива туморната хетерогенност и еволюция под натиска на лечението

Предизвикателството на рядкостта на CTC

Циркулиращите туморни клетки представляват изключително рядка популация в периферната кръв, като обикновено се срещат с честота 1-100 клетки на 10 ml кръв, съдържаща приблизително 50 милиарда червени кръвни клетки и 50 милиона бели кръвни клетки. Тази рядкост - приблизително една КТК на милион до десет милиона ядрени кръвни клетки - изисква високочувствителни и специфични технологии за обогатяване, способни да възстановяват редките събития, като същевременно изчерпват огромния фон от нормални кръвни клетки.

Изобилието на КТК корелира със стадия на заболяването, като при метастатичните пациенти обикновено се откриват повече КТК, отколкото при тези с локализирано заболяване. Въпреки това дори при напреднал рак CTC остават рядкост, а при някои пациенти CTC са неоткриваеми въпреки обширното метастатично заболяване. Тази променливост отразява сложната биология на интравазацията на туморните клетки, оцеляването им в циркулацията и екстравазацията им към отдалечени места.

Клиничната значимост на CTCs като прогностични и предсказващи биомаркери е установена при множество видове рак. Разрешението на FDA за системата CellSearch за определяне на броя на CTC при метастатичен рак на гърдата, простатата и колоректален рак потвърди, че CTC са клинично полезни биомаркери. Изследванията продължават да разширяват приложенията от изброяване до молекулярно характеризиране, което позволява прецизни онкологични подходи.

Имуномагнитни методи за изолиране

Системата CellSearch представлява златен стандарт за платформа за изолиране на ЦТК, одобрена от FDA. При този метод се използват имуномагнитни топчета, конюгирани с антитела анти-EpCAM (молекула на адхезия на епителните клетки), за улавяне на туморни клетки от епителен произход. След магнитното разделяне CTC се идентифицират чрез положително оцветяване за цитокератини и DAPI, а отрицателното оцветяване за левкоцитния маркер CD45 изключва замърсяващите бели кръвни клетки.

Улавянето, базирано на EpCAM, ефикасно обогатява CTC от карциноми, които поддържат епителни фенотипове, но може да пропусне CTC, които са претърпели епително-мезенхимен преход (EMT) и са намалили регулацията на епителните маркери. Свързаните с ЕМТ субпопулации на ЦТК могат да притежават повишен метастатичен потенциал, което прави откриването им клинично важно. Алтернативни или допълнителни антитела за улавяне, насочени към мезенхимни маркери, разширяват откриването на фенотипно разнообразни CTC.

Подходите за отрицателно изчерпване премахват нормалните кръвни клетки, вместо да селектират положително CTCs. Деплетирането, базирано на CD45, премахва левкоцитите, което позволява възстановяването на CTCs независимо от експресията на епителни маркери. Този подход улавя фенотипно разнообразни популации от ЦТК, включително клетки на ЕМТ, но осигурява по-ниска чистота от методите за положителна селекция.

Изолиране на базата на размера и микрофлуидно изолиране

Разделянето на базата на размера използва по-големия диаметър на повечето ЦТК (15-25 μm) в сравнение с левкоцитите (7-15 μm). Филтрирането през мембрани с определени размери на порите (обикновено 8 μm) задържа ЦТК, като същевременно позволява преминаването на по-малки кръвни клетки. Този подход без етикетиране улавя ЦТК независимо от експресията на повърхностни маркери, но може да доведе до загуба на по-малки ЦТК или ЦТК с деформируемост, позволяваща преминаване през порите.

Микрофлуидните устройства позволяват сложна изолация на ЦТК чрез интегрирани принципи на физическо и биологично разделяне. CTC-iChip съчетава детерминирано странично изместване за обогатяване на базата на размера с имуномагнитно изчерпване на левкоцитите. Този подход на отрицателна селекция възстановява жизнеспособни CTC без маркиране с антитела, което може да попречи на култивирането или анализа надолу по веригата.

Микрофлуидните платформи, включващи анти-EpCAM антитела върху повърхностите на чиповете, улавят CTCs при контролирани условия на потока. Тези устройства постигат висока ефективност на улавяне, като същевременно позволяват интегриране с анализ надолу по веригата, включително имунооцветяване на чипа или освобождаване на клетки за култивиране. Паралелизираните микрофлуидни конструкции увеличават производителността за клинични приложения.

Протоколи за култивиране на CTC

Култивирането на ЦТК е свързано със значителни предизвикателства, освен тяхната рядкост. Циркулиращите туморни клетки трябва да оцелеят при отделяне от първичния туморен матрикс, интравазация, циркулационен стрес и имунна атака, като се избират клетки с различни свойства за оцеляване. Тези оцелели клетки често остават спокойни или склонни към апоптоза в стандартните условия на култивиране, оптимизирани за установени клетъчни линии.

Условията на култивиране с изключително ниска степен на привързаност насърчават оцеляването на ЦТК, като предотвратяват аноикис (апоптоза, предизвикана от откъсване). Културата със суспензия в среда за стволови клетки, съдържаща EGF, FGF и инсулин, подпомага пролиферацията на ЦТК, като същевременно запазва свойствата си на инициатор на тумори. Триизмерната сфероидна култура при тези условия обогатява клетките със стволови свойства.

Хипоксичната култура (1-5% O₂) подобрява оцеляването и пролиферацията на ЦТК в сравнение с атмосферния кислород. Хипоксията запазва свойствата на стволовите клетки и намалява оксидативния стрес, който може да ограничи експанзията на ЦТК. Комбинацията от ниско съдържание на кислород със специализирани среди и растежни фактори осигурява условия, благоприятстващи разрастването на ЦТК.

Клетъчни линии, получени от ЦТК, и ксенографти

Успешното създаване на постоянни клетъчни линии, получени от ЦТК, продължава да бъде предизвикателство, като процентът на успеваемост обикновено е под 20 %, дори от метастатични пациенти. Когато бъдат постигнати, тези клетъчни линии осигуряват възобновяеми модели, представящи популацията от метастатични клетки. Клетъчните линии, получени от ЦТК, демонстрират свойства, различни от тези, получени от първични тумори, което отразява селекцията по време на метастатичното разпространение.

Ксенографтите, получени от ЦТК (CDX), генерирани чрез инжектиране на пациентски ЦТК в имунодефицитни мишки, осигуряват модели in vivo за тестване на лекарства и изследвания на метастазите. Степента на създаване на CDX варира в зависимост от вида на рака и количеството на CTC, но е постигната при множество видове тумори. Тези модели запазват характеристиките на тумора на пациента и позволяват терапевтични изследвания, които не са възможни при ограничен брой ЦТК.

За сравнителни изследвания на рака създадените клетъчни линии осигуряват добре характеризирани модели. Клетките A549 представляват аденокарцином на белия дроб за сравнение с CTC от рак на белия дроб. Клетките MCF-7 и CTCs от рак на гърдата позволяват валидиране на модела на рак на гърдата. Клетките HCT116 осигуряват референтни модели за колоректален рак.

Едноклетъчен анализ на CTCs

Едноклетъчното молекулярно профилиране преодолява предизвикателствата на хетерогенността на ЦТК, като анализира отделни клетки, а не обединени популации. Едноклетъчното секвениране на РНК разкрива транскриптомното разнообразие в популациите на ЦТК, като идентифицира субпопулации с различни метастатични или резистентни на лечение свойства. Тази хетерогенност отразява както вътрешното туморно разнообразие, така и адаптацията към циркулаторната среда.

Едноклетъчното секвениране на ДНК идентифицира мутации и промени в броя на копията в отделните ЦТК. Сравнението с първични и метастатични туморни проби проследява клоновата еволюция по време на прогресията на заболяването и лечението. КТК могат да съдържат мутации на резистентност преди клиничното откриване на неуспех на лечението, което позволява ранна намеса.

Анализът на едноклетъчно ниво на белтъци чрез имунофлуоресценция или масова цитометрия характеризира фенотипите на ЦТК, включително състоянието на ЕМТ, маркерите за пролиферация и експресията на лекарствени цели. Тази информация насочва избора на лечение и проследява отговора на едноклетъчно ниво.

Клинични приложения и бъдещи насоки

Определянето на броя на ЦТК предоставя прогностична информация за множество видове рак. По-големият брой CTC корелира с по-лоши резултати, а промените в броя на CTC по време на лечението предсказват отговора. Серийното наблюдение на CTC осигурява оценка на състоянието на заболяването в реално време чрез минимално инвазивни кръвни изследвания.

Тестването на лекарствената чувствителност върху разширени ЦТК или модели, получени от ЦТК, позволява персонализиран избор на лечение. Експонирането ex vivo на пациентски CTCs на кандидат-терапии идентифицира ефективни лечения преди клиничното им прилагане. Този функционален подход за прецизна медицина допълва геномното профилиране за насочване на лечението.

Удостоверяването на клетъчните линии потвърждава идентичността на клетъчните линии, получени от ЦТК, чрез сравняване с туморни проби на пациенти. Тестването на микоплазми гарантира целостта на културата по време на експанзията на ЦТК. Средата за замразяване CM-1 позволява съхраняването на клетки, получени от ЦТК, за надлъжни проучвания.

Заключение

Технологиите за изолиране и култивиране на циркулиращи туморни клетки напреднаха значително, което позволява достъп до тази рядка, но клинично важна клетъчна популация. Многобройните платформи за изолиране се справят с рядкостта и фенотипното разнообразие на ЦТК, докато специализираните условия за култивиране подпомагат експанзията на ЦТК за функционални изследвания. Едноклетъчният анализ разкрива хетерогенността на CTC и тяхната еволюция по време на лечението. Тъй като технологиите продължават да се усъвършенстват, CTCs ще играят все по-голяма роля в прецизната онкология - от прогностично изброяване до функционално изследване на лекарствената чувствителност, което ще направлява персонализирания избор на лечение.