Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Células tumorais circulantes: técnicas de isolamento e protocolos de cultura

As células tumorais circulantes (CTCs) são células cancerosas raras que se desprendem de tumores primários ou de focos metastáticos e passam para a corrente sanguínea. Apesar de sua escassez — normalmente menos de 10 CTCs por mililitro de sangue entre bilhões de células sanguíneas normais —, essas células fornecem informações inestimáveis sobre a biologia do tumor, os mecanismos de metástase e a resposta ao tratamento. Os avanços nas tecnologias de isolamento de CTCs e nos protocolos de cultura agora permitem que os pesquisadores capturem, contem e caracterizem essas células para aplicações em oncologia de precisão, que vão desde diagnósticos por biópsia líquida até testes de sensibilidade a medicamentos ex vivo.

Pontos-chave

• As CTCs ocorrem em frequências extremamente baixas, exigindo tecnologias de enriquecimento altamente sensíveis e específicas
• Os métodos de isolamento exploram propriedades físicas (tamanho, densidade) ou marcadores biológicos (EpCAM) para a captura de CTCs
• O sucesso na cultura de CTCs requer condições especializadas que abordem a resistência à anoikis e os desafios de proliferação
• Linhas celulares e xenoenxertos derivados de CTCs fornecem plataformas para testes de sensibilidade a medicamentos e estudos mecanísticos
• A análise de células individuais das CTCs revela a heterogeneidade e a evolução do tumor sob a pressão do tratamento

Publicado: 2023 | Última revisão: maio de 2026

O desafio da raridade das CTC

As células tumorais circulantes representam uma população extremamente rara no sangue periférico, ocorrendo normalmente em frequências de 1 a 100 células por 10 mL de sangue contendo aproximadamente 50 bilhões de glóbulos vermelhos e 50 milhões de glóbulos brancos. Essa raridade — aproximadamente uma CTC por milhão a dez milhões de células sanguíneas nucleadas — exige tecnologias de enriquecimento altamente sensíveis e específicas, capazes de detectar eventos raros ao mesmo tempo em que eliminam o vasto fundo de células sanguíneas normais.

A abundância de CTCs está correlacionada com o estágio da doença, sendo que pacientes com metástases geralmente apresentam mais CTCs do que aqueles com doença localizada. No entanto, mesmo no câncer avançado, as CTCs continuam sendo raras, e alguns pacientes apresentam CTCs indetectáveis, apesar da doença metastática extensa. Essa variabilidade reflete a complexa biologia da intravasação das células tumorais, sua sobrevivência na circulação e a extravasação para locais distantes.

A importância clínica das CTCs como biomarcadores prognósticos e preditivos foi estabelecida em diversos tipos de câncer. A aprovação pela FDA do sistema CellSearch para contagem de CTCs no câncer de mama, de próstata e colorretal metastático validou as CTCs como biomarcadores clinicamente úteis. As pesquisas continuam expandindo as aplicações, desde a contagem até a caracterização molecular, possibilitando abordagens de oncologia de precisão.

Métodos de isolamento imunomagnético

O sistema CellSearch representa a plataforma padrão-ouro de isolamento de CTCs aprovada pela FDA. Esse método utiliza esferas imunomagnéticas conjugadas a anticorpos anti-EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) para capturar células tumorais de origem epitelial. Após a separação magnética, as CTCs são identificadas por coloração positiva para citoqueratinas e DAPI, com coloração negativa para o marcador leucocitário CD45, o que exclui glóbulos brancos contaminantes.

A captura baseada em EpCAM enriquece eficientemente as CTCs de carcinomas que mantêm fenótipos epiteliais, mas pode deixar de detectar CTCs que passaram por transição epitelial-mesenquimal (EMT) e apresentam marcadores epiteliais regulados para baixo. Subpopulações de CTCs associadas à EMT podem possuir potencial metastático aumentado, tornando sua detecção clinicamente importante. Anticorpos de captura alternativos ou adicionais direcionados a marcadores mesenquimais ampliam a detecção de CTCs fenotipicamente diversos.

Abordagens de depleção negativa removem células sanguíneas normais, em vez de selecionar positivamente as CTCs. A depleção baseada em CD45 remove leucócitos, permitindo a recuperação de CTCs independentemente da expressão de marcadores epiteliais. Essa abordagem captura populações de CTCs fenotipicamente diversas, incluindo células EMT, mas oferece menor pureza do que os métodos de seleção positiva.

Isolamento baseado no tamanho e microfluídico

A separação baseada no tamanho aproveita o diâmetro maior da maioria das CTCs (15–25 μm) em comparação com os leucócitos (7–15 μm). A filtração por membranas com tamanhos de poros definidos (normalmente 8 μm) retém as CTCs, permitindo que células sanguíneas menores passem. Essa abordagem sem marcação captura CTCs independentemente da expressão de marcadores de superfície, mas pode perder CTCs menores ou CTCs com deformabilidade que permitam a passagem pelos poros.

Dispositivos microfluídicos permitem o isolamento sofisticado de CTCs por meio de princípios integrados de separação física e biológica. O CTC-iChip combina deslocamento lateral determinístico para enriquecimento baseado no tamanho com depleção imunomagnética de leucócitos. Essa abordagem de seleção negativa recupera CTCs viáveis sem marcação por anticorpos, o que poderia interferir na cultura ou análise posterior.

Plataformas microfluídicas que incorporam anticorpos anti-EpCAM nas superfícies dos chips capturam CTCs sob condições de fluxo controladas. Esses dispositivos alcançam alta eficiência de captura, ao mesmo tempo em que permitem a integração com análises posteriores, incluindo imunocoloração no chip ou liberação de células para cultura. Projetos microfluídicos paralelizados aumentam a produtividade para aplicações clínicas.

Protocolos de cultura de CTCs

A cultura de CTCs apresenta desafios significativos além de sua raridade. As células tumorais circulantes precisam sobreviver ao desprendimento da matriz do tumor primário, à intravasação, ao estresse de cisalhamento circulatório e ao ataque imunológico — o que seleciona células com propriedades de sobrevivência distintas. Essas sobreviventes frequentemente permanecem quiescentes ou propensas à apoptose em condições de cultura padrão otimizadas para linhagens celulares estabelecidas.

Condições de cultura com aderência ultrabaixa promovem a sobrevivência das CTCs ao prevenir a anoikis (apoptose induzida pelo desprendimento). A cultura em suspensão em meios para células-tronco contendo EGF, FGF e insulina favorece a proliferação das CTCs, mantendo suas propriedades de iniciação tumoral. A cultura esferoidal tridimensional nessas condições enriquece as células com propriedades semelhantes às das células-tronco.

A cultura hipóxica (1–5% de O₂) melhora a sobrevivência e a proliferação das CTCs em comparação com o oxigênio atmosférico. A hipóxia mantém as propriedades das células-tronco e reduz o estresse oxidativo que pode limitar a expansão das CTCs. A combinação de baixo nível de oxigênio com meios especializados e fatores de crescimento proporciona condições que favorecem o crescimento das CTCs.

Linhas celulares derivadas de CTC e xenoenxertos

O estabelecimento bem-sucedido de linhagens celulares permanentes derivadas de CTC continua sendo um desafio, com taxas de sucesso normalmente inferiores a 20%, mesmo em pacientes com metástases. Quando obtidas, essas linhagens celulares fornecem modelos renováveis que representam a população de células metastáticas. As linhagens celulares derivadas de CTC apresentam propriedades distintas das linhagens derivadas de tumores primários, refletindo a seleção ocorrida durante a disseminação metastática.

Os xenoenxertos derivados de CTCs (CDX), gerados pela injeção de CTCs de pacientes em camundongos imunodeficientes, fornecem modelos in vivo para testes de medicamentos e estudos de metástase. As taxas de estabelecimento de CDX variam de acordo com o tipo de câncer e a abundância de CTCs, mas já foram alcançadas em diversos tipos de tumores. Esses modelos mantêm as características do tumor do paciente e possibilitam estudos terapêuticos que não seriam viáveis com um número limitado de CTCs.

Para pesquisas comparativas sobre câncer, as linhagens celulares estabelecidas fornecem modelos bem caracterizados. As células A549 representam o adenocarcinoma de pulmão para comparação com as CTCs do câncer de pulmão. As células MCF-7 e as CTCs do câncer de mama permitem a validação de modelos de câncer de mama. As células HCT116 fornecem modelos de referência para o câncer colorretal.

Análise de célula única de CTCs

O perfil molecular de célula única supera os desafios da heterogeneidade das CTCs ao analisar células individuais, em vez de populações agrupadas. O sequenciamento de RNA de célula única revela a diversidade transcriptômica dentro das populações de CTCs, identificando subpopulações com propriedades metastáticas ou de resistência ao tratamento distintas. Essa heterogeneidade reflete tanto a diversidade intrínseca do tumor quanto a adaptação ao ambiente circulatório.

O sequenciamento de DNA de célula única identifica mutações e alterações no número de cópias em CTCs individuais. A comparação com amostras de tumores primários e metastáticos acompanha a evolução clonal durante a progressão da doença e o tratamento. As CTCs podem abrigar mutações de resistência antes da detecção clínica da falha terapêutica, possibilitando uma intervenção precoce.

A análise de célula única no nível proteico, utilizando imunofluorescência ou citometria de massa, caracteriza fenótipos de CTCs, incluindo o status da EMT, marcadores de proliferação e expressão de alvos farmacológicos. Essas informações orientam a seleção do tratamento e monitoram a resposta no nível da célula única.

Aplicações clínicas e direções futuras

A contagem de CTCs fornece informações prognósticas para diversos tipos de câncer. Contagens mais elevadas de CTCs se correlacionam com resultados mais desfavoráveis, e alterações no número de CTCs durante o tratamento predizem a resposta. O monitoramento serial de CTCs permite a avaliação em tempo real do estado da doença por meio de coleta de sangue minimamente invasiva.

Testes de sensibilidade a medicamentos em CTCs expandidas ou em modelos derivados de CTCs permitem a seleção de tratamentos personalizados. A exposição ex vivo das CTCs do paciente a terapias candidatas identifica tratamentos eficazes antes da administração clínica. Essa abordagem de medicina de precisão funcional complementa o perfil genômico para orientação do tratamento.

A autenticação de linhagens celulares confirma a identidade das linhagens derivadas de CTCs por meio da comparação com amostras tumorais do paciente. Os testes de micoplasma garantem a integridade da cultura durante toda a expansão das CTCs. O meio de congelamento CM-1 permite o armazenamento de células derivadas de CTCs para estudos longitudinais.

Conclusão

As tecnologias de isolamento e cultura de células tumorais circulantes avançaram significativamente, possibilitando o acesso a essa população celular rara, mas clinicamente importante. Várias plataformas de isolamento lidam com a raridade e a diversidade fenotípica das CTCs, enquanto condições de cultura especializadas apoiam a expansão das CTCs para estudos funcionais. A análise de célula única revela a heterogeneidade das CTCs e sua evolução durante o tratamento. À medida que as tecnologias continuam a melhorar, as CTCs desempenharão papéis cada vez mais importantes na oncologia de precisão, desde a contagem prognóstica até testes funcionais de sensibilidade a medicamentos, orientando a seleção de tratamentos personalizados.