Circulating Tumor Cells: Isolation Techniques and Culture Protocols

Células tumorales circulantes: Técnicas de aislamiento y protocolos de cultivo

Las células tumorales circulantes (CTC) son células cancerosas poco frecuentes que se desprenden de los tumores primarios o metastásicos y pasan al torrente sanguíneo. A pesar de su escasez -normalmente menos de 10 CTC por mililitro de sangre entre miles de millones de células sanguíneas normales-, estas células proporcionan información muy valiosa sobre la biología tumoral, los mecanismos metastásicos y la respuesta al tratamiento. Los avances en las tecnologías de aislamiento y los protocolos de cultivo de CTC permiten ahora a los investigadores capturar, enumerar y caracterizar estas células para aplicaciones oncológicas de precisión que van desde el diagnóstico por biopsia líquida hasta las pruebas de sensibilidad a fármacos ex vivo.

Puntos clave

• Las CTC se producen en frecuencias extremadamente bajas que requieren tecnologías de enriquecimiento altamente sensibles y específicas
• Los métodos de aislamiento aprovechan las propiedades físicas (tamaño, densidad) o los marcadores biológicos (EpCAM) para la captura de CTC
• El cultivo satisfactorio de CTC requiere condiciones especializadas que aborden los retos de la resistencia a la anoikis y la proliferación
• Las líneas celulares derivadas de CTC y los xenoinjertos proporcionan plataformas para pruebas de sensibilidad a fármacos y estudios mecanísticos
• El análisis unicelular de las CTC revela la heterogeneidad y la evolución del tumor bajo la presión del tratamiento

El reto de la rareza de las CTC

Las células tumorales circulantes representan una población extremadamente rara en la sangre periférica, con una frecuencia típica de 1-100 células por cada 10 ml de sangre, que contiene aproximadamente 50.000 millones de glóbulos rojos y 50 millones de glóbulos blancos. Esta rareza -aproximadamente una CTC por cada millón a diez millones de células sanguíneas nucleadas- requiere tecnologías de enriquecimiento altamente sensibles y específicas, capaces de recuperar eventos raros al tiempo que eliminan el vasto fondo de células sanguíneas normales.

La abundancia de CTC se correlaciona con el estadio de la enfermedad, y los pacientes metastásicos suelen albergar más CTC que los que padecen una enfermedad localizada. Sin embargo, incluso en el cáncer avanzado, las CTC siguen siendo escasas, y algunos pacientes tienen CTC indetectables a pesar de la extensa enfermedad metastásica. Esta variabilidad refleja la compleja biología de la intravasación de las células tumorales, su supervivencia en circulación y su extravasación a lugares distantes.

La importancia clínica de las CTC como biomarcadores pronósticos y predictivos se ha establecido en múltiples tipos de cáncer. La autorización de la FDA del sistema CellSearch para el recuento de CTC en cáncer metastásico de mama, próstata y colorrectal validó las CTC como biomarcadores clínicamente útiles. La investigación continúa ampliando las aplicaciones desde la enumeración hasta la caracterización molecular, lo que permite enfoques oncológicos de precisión.

Métodos de aislamiento inmunomagnético

El sistema CellSearch representa la plataforma de aislamiento de CTC estándar de oro aprobada por la FDA. Este método utiliza perlas inmunomagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) para capturar células tumorales derivadas de células epiteliales. Tras la separación magnética, las CTC se identifican mediante tinción positiva para citoqueratinas y DAPI, con tinción negativa para el marcador leucocitario CD45 que excluye los leucocitos contaminantes.

La captura basada en EpCAM enriquece eficazmente las CTC de carcinomas que mantienen fenotipos epiteliales, pero puede pasar por alto las CTC que han sufrido una transición epitelio-mesénquima (EMT) y han reducido la regulación de los marcadores epiteliales. Las subpoblaciones de CTC asociadas a EMT pueden poseer un mayor potencial metastásico, lo que hace que su detección sea clínicamente importante. Los anticuerpos de captura alternativos o adicionales dirigidos a marcadores mesenquimales amplían la detección de CTC fenotípicamente diversas.

Los métodos de depleción negativa eliminan las células sanguíneas normales en lugar de seleccionar positivamente las CTC. La depleción basada en CD45 elimina los leucocitos, permitiendo la recuperación de CTC independientemente de la expresión de marcadores epiteliales. Este enfoque captura poblaciones de CTC fenotípicamente diversas, incluidas las células EMT, pero proporciona una pureza menor que los métodos de selección positiva.

Aislamiento basado en el tamaño y microfluídico

La separación basada en el tamaño aprovecha el mayor diámetro de la mayoría de las CTC (15-25 μm) en comparación con los leucocitos (7-15 μm). La filtración a través de membranas con tamaños de poro definidos (normalmente de 8 μm) retiene las CTC y permite el paso de células sanguíneas más pequeñas. Este enfoque sin etiquetas captura las CTC independientemente de la expresión del marcador de superficie, pero puede perder CTC más pequeñas o CTC con deformabilidad que permite el paso a través de los poros.

Los dispositivos microfluídicos permiten un aislamiento sofisticado de las CTC mediante principios integrados de separación física y biológica. El CTC-iChip combina el desplazamiento lateral determinista para el enriquecimiento basado en el tamaño con el agotamiento inmunomagnético de los leucocitos. Este enfoque de selección negativa recupera CTC viables sin etiquetado de anticuerpos que pueda interferir con el cultivo o análisis posterior.

Las plataformas microfluídicas que incorporan anticuerpos anti-EpCAM en las superficies de los chips capturan CTC en condiciones de flujo controlado. Estos dispositivos consiguen una alta eficacia de captura y permiten la integración con análisis posteriores, incluida la inmunotinción en chip o la liberación de células para cultivo. Los diseños microfluídicos en paralelo aumentan el rendimiento de las aplicaciones clínicas.

Protocolos de cultivo de CTC

El cultivo de CTC presenta retos significativos más allá de su rareza. Las células tumorales circulantes deben sobrevivir al desprendimiento de la matriz del tumor primario, a la intravasación, al estrés de cizallamiento circulatorio y al ataque inmunitario, seleccionando células con propiedades de supervivencia distintas. Estas supervivientes suelen permanecer quiescentes o propensas a la apoptosis en condiciones de cultivo estándar optimizadas para líneas celulares establecidas.

Las condiciones de cultivo de fijación ultrabaja favorecen la supervivencia de las CTC al evitar la anoikis (apoptosis inducida por desprendimiento). El cultivo en suspensión en medios de células madre que contienen EGF, FGF e insulina favorece la proliferación de CTC al tiempo que mantiene las propiedades de iniciación tumoral. El cultivo de esferoides tridimensionales en estas condiciones enriquece las células con propiedades similares a las de las células madre.

El cultivo hipóxico (1-5% de O₂) mejora la supervivencia y proliferación de CTC en comparación con el oxígeno atmosférico. La hipoxia mantiene las propiedades de las células madre y reduce el estrés oxidativo que puede limitar la expansión de las CTC. La combinación de oxígeno bajo con medios especializados y factores de crecimiento proporciona condiciones que favorecen la proliferación de CTC.

Líneas celulares y xenoinjertos derivados de CTC

El establecimiento con éxito de líneas celulares permanentes derivadas de CTC sigue siendo un reto, con tasas de éxito típicamente inferiores al 20%, incluso a partir de pacientes metastásicos. Cuando se consiguen, estas líneas celulares proporcionan modelos renovables que representan la población celular metastásica. Las líneas celulares derivadas de CTC muestran propiedades distintas de las líneas derivadas de tumores primarios, lo que refleja la selección durante la diseminación metastásica.

Los xenoinjertos derivados de CTC (CDX) generados mediante la inyección de CTC de pacientes en ratones inmunodeficientes proporcionan modelos in vivo para ensayos farmacológicos y estudios de metástasis. Las tasas de establecimiento de CDX varían según el tipo de cáncer y la abundancia de CTC, pero se han logrado en múltiples tipos de tumores. Estos modelos mantienen las características del tumor del paciente y permiten realizar estudios terapéuticos que no son posibles con un número limitado de CTC.

Para la investigación comparativa del cáncer, las líneas celulares establecidas proporcionan modelos bien caracterizados. Las células A549 representan el adenocarcinoma de pulmón para su comparación con las CTC de cáncer de pulmón. Las células MCF-7 y las CTC de cáncer de mama permiten la validación de modelos de cáncer de mama. Las células HCT116 proporcionan modelos de referencia de cáncer colorrectal.

Análisis unicelular de CTC

Los perfiles moleculares unicelulares superan los retos de la heterogeneidad de las CTC analizando células individuales en lugar de poblaciones agrupadas. La secuenciación unicelular del ARN revela la diversidad transcriptómica dentro de las poblaciones de CTC, identificando subpoblaciones con distintas propiedades metastásicas o resistentes al tratamiento. Esta heterogeneidad refleja tanto la diversidad intrínseca del tumor como su adaptación al entorno circulatorio.

La secuenciación unicelular del ADN identifica mutaciones y alteraciones del número de copias en CTC individuales. La comparación con muestras de tumores primarios y metastásicos permite seguir la evolución clonal durante la progresión de la enfermedad y el tratamiento. Las CTC pueden albergar mutaciones de resistencia antes de la detección clínica del fracaso del tratamiento, lo que permite una intervención temprana.

El análisis unicelular a nivel de proteínas mediante inmunofluorescencia o citometría de masas caracteriza los fenotipos de las CTC, incluidos el estado EMT, los marcadores de proliferación y la expresión de dianas farmacológicas. Esta información guía la selección del tratamiento y monitoriza la respuesta a nivel unicelular.

Aplicaciones clínicas y orientaciones futuras

El recuento de CTC proporciona información pronóstica en múltiples tipos de cáncer. Un mayor recuento de CTC se correlaciona con peores resultados, y los cambios en el número de CTC durante el tratamiento predicen la respuesta. La monitorización seriada de CTC proporciona una evaluación en tiempo real del estado de la enfermedad mediante extracciones de sangre mínimamente invasivas.

Las pruebas de sensibilidad a fármacos en CTC expandidas o en modelos derivados de CTC permiten una selección personalizada del tratamiento. La exposición ex vivo de las CTC de pacientes a terapias candidatas identifica tratamientos eficaces antes de su administración clínica. Este enfoque de medicina de precisión funcional complementa el perfil genómico para la orientación del tratamiento.

La autenticación de líneas celulares confirma la identidad de las líneas celulares derivadas de CTC mediante la comparación con muestras de tumores de pacientes. Las pruebas de micoplasma garantizan la integridad del cultivo durante la expansión de las CTC. El medio de congelación CM-1 permite el almacenamiento de células derivadas de CTC para estudios longitudinales.

Conclusión

Las tecnologías de aislamiento y cultivo de células tumorales circulantes han avanzado significativamente, permitiendo el acceso a esta población celular poco frecuente pero clínicamente importante. Las múltiples plataformas de aislamiento abordan la rareza y diversidad fenotípica de las CTC, mientras que las condiciones de cultivo especializadas favorecen la expansión de las CTC para estudios funcionales. El análisis unicelular revela la heterogeneidad de las CTC y su evolución durante el tratamiento. A medida que las tecnologías sigan mejorando, las CTC desempeñarán un papel cada vez más importante en la oncología de precisión, desde la enumeración pronóstica hasta las pruebas funcionales de sensibilidad a fármacos que guían la selección personalizada del tratamiento.