Основи на клетъчната култура

Първични клетки срещу безсмъртни клетъчни линии

Първичните клетки се изолират директно от тъкани и се поставят в култура за първи път. Тъй като те остават по-близо до тъканта, от която произхождат, те често отразяват естественото клетъчно поведение по-вярно, отколкото отдавна установените лабораторни модели. По тази причина първичните клетки са особено ценни, когато физиологичната релевантност е важна. В същото време те често са по-чувствителни, могат да растат по-бавно и обикновено имат по-строги изисквания за култивиране в сравнение с утвърдените клетъчни линии.

Имуortaliziraneте клетъчни линии, от друга страна, са придобили способността да се размножават отвъд нормалния жизнен цикъл на първичните клетки. Това може да се случи спонтанно или да бъде предизвикано умишлено чрез трансформация или генетична модификация. Имуortaliziraneте клетъчни линии се използват широко, тъй като обикновено са по-лесни за поддържане, по-лесно достъпни и по-подходящи за рутинни и мащабни експерименти. Те често са устойчиви, възпроизводими и добре характеризирани.

Това удобство обаче има и своите недостатъци. Имуortalizirane клетките могат да се различават от оригиналната тъкан по отношение на морфологията, генната експресия, метаболизма и реакцията към стимули. В резултат на това те не винаги отразяват биологичната ситуация in vivo толкова точно, колкото първичните клетки. Изборът между първични клетки и безсмъртни клетъчни линии следователно зависи от целта на експеримента, изискваното ниво на физиологична релевантност и практическите изисквания на работния процес.

Клетъчни линии с ограничен среден живот срещу клетъчни линии с непрекъснат среден живот

Термините „краен“ и „непрекъснат“ описват продължителността на пролиферацията на култивираните клетки. Крайните клетъчни линии могат да се делят само ограничен брой пъти, преди да навлязат в стадия на стареене и да спрат да пролиферират. Тази ограничена продължителност на живота е нормално биологично свойство на много нетрансформирани клетки и често се свързва с по-физиологичен фенотип.

Неограничените клетъчни линии, от друга страна, са способни да пролиферират безкрайно при подходящи условия на култивиране. Тези линии често са иммортализирани и следователно са изключително полезни за дългосрочни експерименти, рутинна лабораторна работа и приложения, които изискват стабилен и лесно достъпен източник на клетки. Удължената им продължителност на живота ги прави удобни, но това също означава, че с течение на времето те могат да натрупат генетични или фенотипни промени.

Въпреки че двете разграничения са тясно свързани, те не са точно същите като „първични“ срещу „имуortalizirani“. Термините „първични“ и „имуortalizirani“ описват произхода или биологичния статус на дадена култура, докато „ограничени“ и „непрекъснати“ се отнасят конкретно до нейния потенциал за растеж във времето. Разбирането на тази разлика помага при избора на моделна система и при интерпретирането на експерименталните резултати.

Обща терминология

Клетъчната култура се основава на редица основни термини, които се използват в протоколи, публикации и ежедневната лабораторна работа. Разбирането на тази терминология е от съществено значение за правилното четене на експерименталните инструкции, документирането на работните процеси и оценяването на състоянието на културата.

Конфлуентност

Конфлуентността описва колко от наличната повърхност за растеж е покрита от клетки. Тя се използва главно за адхезивни култури, при които клетките се прикрепват към повърхността на колба, чаша или плака. Култура с 50% конфлуентност покрива приблизително половината от повърхността, докато култура с 100% конфлуентност образува пълен клетъчен слой.

Този параметър е важен, защото помага да се определи подходящият момент за пасажиране, третиране или анализ. Ако адхезивните клетки станат прекалено конфлуентни, тяхното поведение при растеж, морфологията и метаболизмът им могат да се променят. По тази причина наблюдението на конфлуентността е рутинна част от поддържането на здрави култури. При суспензионните култури клетъчната плътност обикновено е по-информативна от конфлуентността.

Номер на пасажа

Броят на пасажите показва колко пъти дадена култура е била субкултивирана от момента на първоначалното ѝ създаване, получаване или размразяване, в зависимост от използваната система за преброяване. Всеки път, когато клетките се разделят в нови съдове, броят на пасажите се увеличава.

Проследяването на броя на пасажите е важно, тъй като клетките могат да се променят с течение на времето в културата. С увеличаването на броя на пасажите някои видове клетки могат да проявят променени характеристики на растежа, морфологията, генната експресия или експерименталните реакции. Поради това последователното водене на записи спомага за подобряване на възпроизводимостта и улеснява сравняването на резултатите между експериментите и между лабораториите.

Време за удвояване

Времето за удвояване се отнася до средното време, необходимо на клетъчната популация да удвои броя си при определени условия на култивиране. То е един от най-полезните показатели за поведението на растежа и може да варира значително между различните видове клетки и клетъчни линии.

Стабилното време за удвояване често показва, че културата е здрава и расте при подходящи условия. Ако времето за удвояване се промени неочаквано, това може да е признак за стрес, неоптимални условия на култивиране, замърсяване или променено поведение на клетките. Тъй като то зависи силно от състава на средата, температурата, плътността на засяване и други фактори, времето за удвояване винаги трябва да се тълкува в контекста.

Жизнеспособност

Жизнеспособността описва дела на живите клетки в дадена популация. Тя обикновено се оценява след размразяване, по време на рутинна култура, преди експерименти по засяване или след излагане на лечение. Високата жизнеспособност обикновено показва, че клетките са в добро състояние и са подходящи за по-нататъшна работа.

Намаляването на жизнеспособността може да бъде резултат от много фактори, включително механичен стрес, неподходящи условия на култивиране, токсични съединения или замърсяване. Жизнеспособността често се измерва заедно с общия брой клетки, за да се получи по-пълна представа за качеството на културата. На практика това е един от ключовите параметри, използвани за вземане на решение дали дадена култура трябва да бъде продължена, оптимизирана или изхвърлена.

Морфология

Морфологията се отнася до видимия външен вид на клетките под микроскоп, включително тяхната форма, размер, подреждане и начин на прикрепване. Много видове клетки имат характерна морфология, когато са здрави, и опитни потребители често разпознават проблемите първо чрез наблюдение на промени във външния вид на клетките.

Променената морфология може да е признак за стрес, диференциация, стареене, замърсяване или неподходящи условия на култивиране. Например, клетките могат да станат необичайно закръглени, уголемени, зърнести, откъснати или с нередовна форма. Редовното микроскопско наблюдение е следователно съществена част от рутинната работа с клетъчни култури и предоставя ценна информация, която надхвърля простото отчитане на броя на клетките.

Основни изисквания за растеж

За да оцелеят и да се размножават in vitro, клетките се нуждаят от стабилна и благоприятна среда. Дори малки отклонения в условията на култивиране могат да повлияят на скоростта на растеж, метаболизма, морфологията и възпроизводимостта на експеримента. Най-важните фактори включват температура, CO₂, влажност, pH, състав на средата и добавки.

Температура

Температурата е един от най-фундаменталните параметри в клетъчната култура, тъй като влияе върху ензимната активност, метаболизма, функцията на мембраните и цялостната клетъчна физиология. Повечето клетки на бозайници се култивират при 37 °C, което отразява нормалната телесна температура. Не всички видове клетки обаче изискват едни и същи условия, а препоръчителните температури могат да варират в зависимост от вида и приложението.

Колебанията в температурата могат да подложат клетките на стрес и да повлияят на прикрепването, растежа и възстановяването им след манипулации. По тази причина културите трябва да се държат извън инкубатора само толкова дълго, колкото е необходимо, а работата на инкубатора трябва да се наблюдава редовно. Поддържането на стабилна температура е от съществено значение както за здравето на клетките, така и за последователността на експеримента.

Въглероден диоксид

В много системи за култивиране на бозайници CO_₂ играе централна роля за поддържането на правилното pH на средата. Това се дължи на факта, че много среди използват буферна система на базата на бикарбонат, която е проектирана да функционира в равновесие с определена концентрация _на CO_₂. Обичайна е настройка от 5% CO_₂, въпреки че някои формулировки на среди или конкретни видове клетки могат да изискват различни условия.

Ако нивото _на CO_₂ не съответства на буферната система на средата, рН може да се промени и да повлияе негативно на растежа и функционирането на клетките. Ето защо настройките на инкубатора и съставът на средата трябва винаги да се разглеждат заедно. На практика правилният контрол _на CO_₂ е основно изискване за поддържане на стабилна културална среда.

Влажност

Високата влажност в инкубатора спомага за предотвратяване на изпаряването от съдовете за култура. Това е особено важно, тъй като изпаряването променя концентрацията на соли, хранителни вещества и други разтворени компоненти в средата. В резултат на това осмоларността може да се повиши, което може да се отрази негативно на здравето на клетките и на резултатите от експеримента.

Затова инкубаторите за клетъчни култури обикновено работят при висока влажност, често с помощта на резервоар за вода. Поддържането на тази среда става особено важно при работа с малки обеми култура, тъй като те са по-чувствителни към изпаряването. Добрият контрол на влажността допринася за стабилни и възпроизводими условия на култивиране във времето.

pH

pH на културната среда оказва пряко влияние върху много клетъчни процеси, включително ензимната активност, мембранния транспорт и метаболитните функции. Повечето клетки на бозайници растат най-добре в относително тесен диапазон на pH, обикновено около 7,2 до 7,4. Дори незначителни отклонения могат да повлияят на растежа, морфологията и жизнеспособността.

Промените в рН могат да бъдат резултат от променени нива _на CO₂, клетъчния метаболизъм, състава на средата или продължителното излагане на средата на стаен въздух. Много среди съдържат фенол червено като визуален индикатор за рН, така че промените в рН често са съпроводени от забележима промяна в цвета. Следователно мониторингът на рН е важна част от оценката на стабилността на културата.

Среди

Културната среда осигурява хранителните вещества и химичната среда, от които клетките се нуждаят, за да оцелеят и растат. В зависимост от състава си тя може да съдържа соли, аминокиселини, витамини, глюкоза, буферни компоненти и други съществени вещества. Различните видове клетки често изискват различни среди, а изборът на среда може силно да повлияе на поведението на клетките и резултатите от експеримента.

Често използваните среди включват формулировки като DMEM, RPMI 1640, EMEM и Ham's F-12, както и много други. На практика средите често се допълват със серум, растежни фактори или допълнителни компоненти в зависимост от нуждите на клетките. Изборът на подходяща среда е следователно централна част от създаването на надеждни условия за култивиране.

Серум

Серумът е често срещана добавка в средите за клетъчна култура и осигурява сложна смес от растежни фактори, хормони, липиди, преносителни протеини и компоненти, подпомагащи прикрепването. Феталният телешки серум, често съкращаван като FBS, се използва широко, тъй като подпомага растежа на много различни видове клетки и може да направи условията за култивиране по-стабилни.

В същото време серумът въвежда вариабилност, тъй като точният му състав може да се различава между отделните партиди. Това може да повлияе на възпроизводимостта, особено при чувствителни анализи. Поради тази причина в някои приложения вместо него се използват среди с намалено съдържание на серум, без серум или химически дефинирани среди. Необходимостта от серум зависи от типа клетки, целта на експеримента и необходимото ниво на стандартизация.

Адхезивна срещу суспензионна култура

Едно от най-важните практически разграничения в клетъчната култура е дали клетките се отглеждат като адхезивни или суспензионни култури. Адхезивните клетки се нуждаят от повърхност за прикрепване и растеж, докато суспензионните клетки остават свободно разпределени в културната среда. Тази разлика засяга почти всяка част от работния процес, включително избора на съд, мониторинга, пасажирането и събирането.

Адхезивната култура е често срещана при клетки, произхождащи от твърди тъкани, като например много епителни клетки, фибробласти и други типове клетки, зависими от закрепване. Тези култури обикновено се наблюдават чрез проследяване на морфологията и конфлуентността, а пасажирането обикновено изисква етап на отделяне преди повторно засяване. Суспензионната култура, от друга страна, е често срещана при много клетки, произхождащи от кръвта, и други неадхезивни типове клетки. Тези култури обикновено се оценяват по клетъчната плътност, жизнеспособността и степента на слепване в средата.

Нито един от двата формата не е по-добър по своята същност; всеки от тях е подходящ за различни биологични въпроси и технически приложения. Адхезивните култури често са предимство, когато формата на клетките, прикрепването или повърхностните взаимодействия са важни, докато суспензионните култури често са по-лесни за мащабиране и работа при работни процеси с голям обем. Разбирането на това какъв тип култура се използва е от съществено значение за избора на правилната стратегия за работа още от самото начало.