Съживяване на клетките след криоконсервация

Клетките, тъканите и дори някои видове могат да бъдат съхранявани за продължителен период от време и след това да бъдат възстановени за по-нататъшно изследване. В тази статия са разгледани различните процедури, използвани за размразяване на клетки при криоконсервация, и са дадени насоки за съживяване и гарантиране на жизнеспособността на клетките. Важно е обаче да следвате стриктно инструкциите, дадени от вашия доставчик на клетъчни култури.

Основни изводи

• Размразяването на клетките е важна стъпка в процеса на криоконсервация, която включва постепенното затопляне на замразените клетки до стайна температура.
• За размразяване на ракови клетки и стволови клетки се препоръчва бавно размразяване на флаконите, тъй като това намалява риска от увреждане на клетките.
• По време на размразяването скоростта на размразяване, температурата и излагането на криопротектор са фактори, които могат да причинят увреждане на клетките.
• Съживяването на клетките изисква да им се осигурят необходимите за растежа им хранителни вещества и минерали.
• След съживяването на клетките и преди да ги използвате в експерименти, е необходимо да проверите клетките за увреждане и жизнеспособност, както и да наблюдавате техния растеж и пролиферация.
• За да се гарантира успешното размразяване и съживяване на клетките, е важно да се спазват препоръчаните указания и протоколи, да се работи внимателно с клетките и да се води точна документация.

Протокол за размразяване

1. Бързо размразете клетките на водна баня с температура 37 °C за 1 - 2 минути, докато в криовиола остане само малка бучка лед.
   • От този момент нататък всички процедури трябва да се извършват при асептични условия.
2. Прехвърлете криовиала в дезинфекциран стерилен шкаф.
3. Внимателно отворете флакона и използвайте серологична пипета с обем 2 ml, за да определите общия брой клетки, като измерите общия обем на клетъчния разтвор. След това отстранете 20 µl от клетките за преброяване като аликвотна част.
4. Поставете клетъчната суспензия в 15-милилитрова центрофужна епруветка, която съдържа 8 ml хранителна среда (стайна температура).
5. Суспендирайте клетките внимателно.
6. Центрофугирайте в продължение на 3 минути при 300 x g и изхвърлете супернатантата.
   • Етапът на центрофугиране може да се пропусне и клетките да се поставят в колба за клетъчни култури веднага, но не забравяйте да смените средата 24 часа по-късно.
7. Незабавно поставете клетките в 10 ml свежа среда за клетъчни култури (предварително затоплена до стайна температура или 37 °C в инкубатор), за да осигурите хранителни вещества за растежа и да разредите криопротектора, като например DSMO. Като криопротектор ДМСО предпазва клетките от увреждане, причинено от замразяване, като предотвратява образуването на ледени кристали, но при високи концентрации може да бъде токсичен за клетките. Две колби Т25 за клетъчни култури трябва да се напълнят с клетки.
8. Поставете клетките в инкубатор и сменете средата на следващия ден.
9. Продължете инкубирането на съживените клетки, както е указано за тази конкретна клетъчна линия.
10. Преди да извършите експериментите си, оставете размразените клетки да се възстановят в хранителна среда, за да могат клетките да се възстановят от стреса при размразяване. Също така проверете клетките за увреждане и жизнеспособност чрез микроскопско наблюдение или чрез провеждане на тест за жизнеспособност и наблюдавайте растежа на клетките.

Забележка: Не забравяйте да потърсите и зададете температурата на инкубиране и_{CO2, подходящи за} вашите клетки! Повечето клетки се инкубират при 37 °C, но някои клетки на насекоми например изискват по-ниски температури.

Защо размразяването е стресиращо за клетките?

Процесът на размразяване излага клетките на потенциално вредни промени в околната среда, както е описано по-долу:

• Температурни промени: Клетките могат да бъдат увредени при преминаването от криогенни към по-високи температури. Термичният шок по време на размразяването може да увреди мембраните, ензимите и други клетки.
• Осмотични промени: Колебанията на осмотичното налягане по време на размразяването могат да увредят клетъчната мембрана и други структури. Токсични вещества могат да попаднат в клетки, които са били криоконсервирани с DMSO или глицерол.
• Отстраняване на криопротектора: Криопротекторите се добавят към клетките преди замразяване, за да предотвратят образуването на ледени кристали, но те са токсични, ако не бъдат отстранени след размразяването.
• Промени в рН: Промените в рН по време на размразяването могат да причинят стрес на клетките. Температурните промени или освобождаването на метаболитни отпадни продукти могат да предизвикат промени в рН.
• Механичен стрес: По време на размразяването клетките се пипетират и центрофугират, което може да доведе до механичен стрес. Това може да увреди клетките и да намали тяхната жизнеспособност.

Размразяването може да доведе до стрес на клетките и да увреди тяхната жизнеспособност и функция. Криопротекторите и добрият протокол за размразяване могат да сведат до минимум това увреждане.

5 съвета за успешно размразяване и съживяване на клетки

1. Използвайте протокол за размразяване на клетките, специфичен за типа клетки, които се размразяват, като например техника за бавно размразяване на ракови клетки и стволови клетки.
2. Намалете излагането на високи температури и удълженото време на размразяване, за да сведете до минимум риска от увреждане на клетките.
3. По време на размразяването и съживяването боравете внимателно с клетките, за да избегнете тяхното увреждане.
4. Проверявайте клетките за повреди и жизнеспособност и проследявайте растежа им, преди да ги използвате в експерименти.

Придържайте се към препоръчаните протоколи и указания за размразяване и съживяване на криоконсервирани клетки.