Cellen weer tot leven wekken na cryopreservatie

Cellen, weefsels en zelfs sommige diersoorten kunnen voor langere tijd worden bewaard en vervolgens worden teruggehaald voor verder onderzoek. In dit artikel wordt ingegaan op de verschillende procedures die worden gebruikt voor het ontdooien van cellen in cryobewaring en worden richtlijnen gegeven voor het opnieuw tot leven wekken en de levensvatbaarheid van de cellen. Het is echter belangrijk om de instructies van je leverancier van celkweek nauwgezet op te volgen.

Belangrijke opmerkingen

• Het ontdooien van cellen is een cruciale stap in het cryopreservatieproces, waarbij bevroren cellen geleidelijk worden opgewarmd tot kamertemperatuur.
• Voor het ontdooien van kankercellen en stamcellen wordt aanbevolen om de flacons langzaam te ontdooien omdat dit het risico op celbeschadiging vermindert.
• Tijdens het ontdooien zijn de ontdooisnelheid, de temperatuur en de blootstelling aan cryoprotectant allemaal factoren die celschade kunnen veroorzaken.
• Om cellen nieuw leven in te blazen, moeten ze worden voorzien van de voedingsstoffen en mineralen die ze nodig hebben om te groeien.
• Nadat de cellen opnieuw tot leven zijn gewekt en voordat ze in experimenten worden gebruikt, is het noodzakelijk om de cellen te controleren op schade en levensvatbaarheid en om hun groei en proliferatie te controleren.
• Voor een succesvolle ontdooiing en revival van cellen is het essentieel om de aanbevolen richtlijnen en protocollen te volgen, voorzichtig met de cellen om te gaan en een nauwkeurige administratie bij te houden.

Ontdooiprotocol

1. Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C gedurende 1 - 2 minuten totdat er alleen nog een klein ijsklontje in de cryovial zit.
   • Vanaf dit punt moeten alle procedures worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.
2. Breng de cryoflacon over naar een ontsmette steriele flowkast.
3. Open de flacon voorzichtig en gebruik een serologische pipet van 2 ml om het totale aantal cellen te bepalen door het totale volume van de celoplossing te meten. Neem vervolgens 20 µL cellen af als aliquot om te tellen.
4. Plaats de celsuspensie in een centrifugebuis van 15 ml met 8 ml kweekmedium (kamertemperatuur).
5. Suspendeer de cellen voorzichtig.
6. Centrifugeer 3 minuten bij 300 x g en gooi het supernatant weg.
   • De centrifugeerstap kan worden weggelaten en de cellen kunnen onmiddellijk in een celkweekkolf worden geplaatst, maar zorg ervoor dat het medium 24 uur later wordt ververst.
7. Plaats de cellen onmiddellijk in 10 ml vers celkweekmedium (voorverwarmd tot kamertemperatuur of 37 °C in een incubator) om groeivoeding te leveren en het cryoprotectant, zoals DSMO, te verdunnen. Als cryoprotectant beschermt DMSO cellen tegen schade door bevriezing door de vorming van ijskristallen te voorkomen, maar het kan bij hoge concentraties toxisch zijn voor cellen. Twee T25 celkweekflessen moeten worden gevuld met cellen.
8. Plaats de cellen in een incubator en ververs het medium de volgende dag.
9. Ga door met het incuberen van de gerevitaliseerde cellen zoals aangegeven voor deze specifieke cellijn.
10. Voordat je je experimenten uitvoert, laat je de ontdooide cellen herstellen in kweekmedium zodat de cellen kunnen herstellen van de ontdooistress. Controleer de cellen ook op schade en levensvatbaarheid door microscopische observatie of door een levensvatbaarheidstest uit te voeren, en controleer de groei van de cellen.

Opmerking: Vergeet niet de incubatietemperatuur en_CO2 in te stellen_{die geschikt} zijn voor jouw cellen! De meeste cellen worden geïncubeerd bij 37 °C, maar sommige insectencellen hebben bijvoorbeeld lagere temperaturen nodig.

Waarom is ontdooien stressvol voor cellen?

Het ontdooiproces stelt de cellen bloot aan mogelijk schadelijke omgevingsveranderingen zoals hieronder beschreven:

• Temperatuurveranderingen: Cellen kunnen beschadigd raken tijdens de overgang van cryogene naar warmere temperaturen. Thermische schokken tijdens het ontdooien kunnen membranen, enzymen en andere cellen beschadigen.
• Osmotische veranderingen: Osmotische drukschommelingen tijdens het ontdooien kunnen het celmembraan en andere structuren beschadigen. Giftige stoffen kunnen cellen binnendringen die cryobewaard zijn met DMSO of glycerol.
• Verwijdering van cryoprotectant: Cryoprotectantia worden voor het invriezen aan cellen toegevoegd om ijskristalvorming te voorkomen, maar ze zijn giftig als ze na het ontdooien niet worden verwijderd.
• Veranderingen in pH: pH-veranderingen tijdens het ontdooien kunnen cellen onder stress zetten. Temperatuurveranderingen of het vrijkomen van metabolische afvalproducten kunnen pH-veranderingen veroorzaken.
• Mechanische stress: Als cellen tijdens het ontdooien worden gepipetteerd en gecentrifugeerd, kan er mechanische stress optreden. Dit kan cellen beschadigen en hun levensvatbaarheid verminderen.

Ontdooien kan cellen belasten en hun levensvatbaarheid en functie aantasten. Cryoprotectanten en een goed ontdooiprotocol kunnen deze schade minimaliseren.

5 tips voor succesvol ontdooien en reanimeren van cellen

1. Gebruik een protocol voor het ontdooien van cellen dat specifiek is voor het type cellen dat ontdooid wordt, zoals een langzame ontdooitechniek voor kankercellen en stamcellen.
2. Beperk de blootstelling aan hoge temperaturen en verleng de ontdooitijd om het risico op celbeschadiging te minimaliseren.
3. Behandel de cellen voorzichtig tijdens het ontdooien en de revival om schade te voorkomen.
4. Inspecteer de cellen op schade en levensvatbaarheid en volg hun groei voordat je ze in experimenten gebruikt.

Houd u aan de aanbevolen protocollen en richtlijnen voor het ontdooien en opnieuw tot leven wekken van gecryopreserveerde cellen.