Oživenie buniek po kryokonzervácii

Bunky, tkanivá a dokonca aj niektoré druhy možno skladovať dlhší čas a potom ich obnoviť na ďalšie štúdium. Tento článok sa zaoberá rôznymi postupmi používanými na rozmrazovanie buniek pri kryokonzervácii a poskytuje návod na oživenie a zabezpečenie životaschopnosti buniek. Je však dôležité dôsledne dodržiavať pokyny, ktoré vám poskytol poskytovateľ bunkových kultúr.

Kľúčové poznatky

• Rozmrazovanie buniek je kľúčovým krokom v procese kryokonzervácie, ktorý zahŕňa postupné zahrievanie zmrazených buniek na izbovú teplotu.
• Pri rozmrazovaní rakovinových buniek a kmeňových buniek sa odporúča rozmrazovať fľaštičky pomaly, pretože sa tým znižuje riziko poškodenia buniek.
• Počas rozmrazovania sú rýchlosť rozmrazovania, teplota a pôsobenie kryoprotektíva faktormi, ktoré môžu spôsobiť poškodenie buniek.
• Oživenie buniek si vyžaduje poskytnúť im živiny a minerály, ktoré potrebujú na rast.
• Po oživení buniek a pred ich použitím v experimentoch je potrebné skontrolovať bunky z hľadiska ich poškodenia a životaschopnosti, ako aj monitorovať ich rast a proliferáciu.
• Na zabezpečenie úspešného rozmrazovania a oživovania buniek je nevyhnutné dodržiavať odporúčané usmernenia a protokoly, zaobchádzať s bunkami opatrne a viesť presné záznamy.

Protokol rozmrazovania

1. Rýchlo rozmrazujte bunky vo vodnom kúpeli s teplotou 37 °C počas 1 - 2 minút, kým v kryovialke nezostane len malá hrudka ľadu.
   • Od tohto momentu sa všetky postupy musia vykonávať za aseptických podmienok.
2. Preneste kryovialku do dezinfikovanej sterilnej prietokovej skrine.
3. Opatrne otvorte injekčnú liekovku a pomocou 2 ml serologickej pipety určte celkový počet buniek zmeraním celkového objemu bunkového roztoku. Potom odoberte 20 µl buniek na počítanie ako alikvotnú časť.
4. Vložte bunkovú suspenziu do 15 ml odstredivky, ktorá obsahuje 8 ml kultivačného média (izbová teplota).
5. Bunky opatrne suspendujte.
6. Centrifugujte 3 minúty pri 300 x g a supernatant zlikvidujte.
   • Krok odstreďovania sa môže vynechať a bunky sa môžu okamžite umiestniť do banky s bunkovou kultúrou, ale nezabudnite vymeniť médium o 24 hodín neskôr.
7. Bunky ihneď umiestnite do 10 ml čerstvého média na kultiváciu buniek (predohriateho na izbovú teplotu alebo 37 °C v inkubátore), aby sa zabezpečili rastové živiny a zriedil kryoprotektant, napríklad DSMO. DMSO ako kryoprotektant chráni bunky pred poškodením spôsobeným zmrazením tým, že zabraňuje tvorbe ľadových kryštálov, ale vo vysokých koncentráciách môže byť pre bunky toxický. Bunky by sa mali naplniť do dvoch baniek T25.
8. Umiestnite bunky do inkubátora a na druhý deň vymeňte médium.
9. Pokračujte v inkubácii oživených buniek podľa pokynov pre túto konkrétnu bunkovú líniu.
10. Pred vykonaním experimentov nechajte rozmrazené bunky zotaviť v kultivačnom médiu, aby sa bunky mohli zotaviť zo stresu spôsobeného rozmrazovaním. Taktiež skontrolujte poškodenie a životaschopnosť buniek mikroskopickým pozorovaním alebo vykonaním testu životaschopnosti a sledujte rast buniek.

Poznámka: Nezabudnite si vyhľadať a nastaviť inkubačnú teplotu a_{CO2 vhodné pre} vaše bunky! Väčšina buniek sa inkubuje pri teplote 37 °C, ale napríklad niektoré bunky hmyzu vyžadujú nižšie teploty.

Prečo je rozmrazovanie pre bunky stresujúce?

Proces rozmrazovania vystavuje bunky potenciálne škodlivým zmenám prostredia, ktoré sú opísané nižšie:

• Teplotné zmeny: Bunky sa môžu poškodiť pri prechode z kryogénnej teploty na vyššiu. Tepelný šok počas rozmrazovania môže poškodiť membrány, enzýmy a iné bunky.
• Osmotické zmeny: Kolísanie osmotického tlaku počas rozmrazovania môže poškodiť bunkovú membránu a iné štruktúry. Toxické látky sa môžu dostať do buniek, ktoré boli kryokonzervované pomocou DMSO alebo glycerolu.
• Odstránenie kryoprotektantov: Kryoprotektanty sa pridávajú do buniek pred zmrazením, aby sa zabránilo tvorbe ľadových kryštálov, ale ak sa po rozmrazení neodstránia, sú toxické.
• Zmeny pH: Zmeny pH počas rozmrazovania môžu spôsobiť stres buniek. Zmeny teploty alebo uvoľňovanie metabolických odpadových produktov môžu spôsobiť zmeny pH.
• Mechanický stres: Počas rozmrazovania sa bunky pipetujú a odstreďujú, čo môže spôsobiť mechanický stres. Ten môže poškodiť bunky a znížiť ich životaschopnosť.

Rozmrazovanie môže spôsobiť stres buniek a poškodiť ich životaschopnosť a funkciu. Kryoprotektanty a dobrý protokol rozmrazovania môžu toto poškodenie minimalizovať.

5 tipov na úspešné rozmrazovanie a oživovanie buniek

1. Používajte protokol na rozmrazovanie buniek špecifický pre typ rozmrazovaných buniek, napríklad techniku pomalého rozmrazovania rakovinových a kmeňových buniek.
2. Znížte vystavenie vysokým teplotám a predĺženému času rozmrazovania, aby ste minimalizovali riziko poškodenia buniek.
3. Počas rozmrazovania a oživovania manipulujte s bunkami opatrne, aby nedošlo k ich poškodeniu.
4. Pred použitím buniek v experimentoch skontrolujte ich poškodenie a životaschopnosť a sledujte ich rast.

Pri rozmrazovaní a oživovaní kryokonzervovaných buniek dodržiavajte odporúčané protokoly a pokyny.