Ożywianie komórek po kriokonserwacji

Komórki, tkanki, a nawet niektóre gatunki mogą być przechowywane przez dłuższy czas, a następnie odzyskiwane do dalszych badań. W niniejszym artykule omówiono różne procedury stosowane do rozmrażania komórek w procesie kriokonserwacji oraz przedstawiono wskazówki dotyczące ożywiania i zapewniania żywotności komórek. Ważne jest jednak, aby ściśle przestrzegać instrukcji podanych przez dostawcę kultury komórkowej.

Kluczowe wnioski

• Rozmrażanie komórek jest kluczowym krokiem w procesie kriokonserwacji, który polega na stopniowym ogrzewaniu zamrożonych komórek do temperatury pokojowej.
• W przypadku rozmrażania komórek nowotworowych i macierzystych zaleca się powolne rozmrażanie fiolek, ponieważ zmniejsza to ryzyko uszkodzenia komórek.
• Podczas rozmrażania, szybkość rozmrażania, temperatura i ekspozycja na krioprotektant są czynnikami, które mogą powodować uszkodzenie komórek.
• Ożywienie komórek wymaga dostarczenia im składników odżywczych i minerałów potrzebnych do wzrostu.
• Po ożywieniu komórek i przed użyciem ich w eksperymentach, konieczne jest sprawdzenie komórek pod kątem uszkodzeń i żywotności, a także monitorowanie ich wzrostu i proliferacji.
• Aby zapewnić pomyślne rozmrożenie i ożywienie komórek, konieczne jest przestrzeganie zalecanych wytycznych i protokołów, ostrożne obchodzenie się z komórkami i prowadzenie dokładnej dokumentacji.

Protokół rozmrażania

1. Szybko rozmrażaj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 1-2 minuty, aż w kriowialni pozostanie tylko niewielka grudka lodu.
   • Od tego momentu wszystkie procedury muszą być wykonywane w warunkach aseptycznych.
2. Przenieść fiolkę do odkażonej sterylnej komory przepływowej.
3. Ostrożnie otwórz fiolkę i użyj pipety serologicznej o pojemności 2 ml, aby określić całkowitą liczbę komórek, mierząc całkowitą objętość roztworu komórek. Następnie pobrać 20 µL komórek do zliczenia jako porcję.
4. Umieścić zawiesinę komórek w 15 ml probówce wirówkowej zawierającej 8 ml podłoża hodowlanego (temperatura pokojowa).
5. Ostrożnie zawiesić komórki.
6. Wirować przez 3 minuty z prędkością 300 x g i odrzucić supernatant.
   • Etap wirowania można pominąć i natychmiast umieścić komórki w kolbie do hodowli komórkowej, ale należy pamiętać o zmianie pożywki 24 godziny później.
7. Natychmiast umieścić komórki w 10 ml świeżego podłoża do hodowli komórkowej (ogrzanego do temperatury pokojowej lub 37°C w inkubatorze) w celu dostarczenia składników odżywczych i rozcieńczenia krioprotektantu, takiego jak DSMO. Jako krioprotektant, DMSO chroni komórki przed uszkodzeniami spowodowanymi przez zamrażanie, zapobiegając tworzeniu się kryształków lodu, ale może być toksyczny dla komórek w wysokich stężeniach. Dwie kolby T25 do hodowli komórkowej powinny być wypełnione komórkami.
8. Umieść komórki w inkubatorze i zmień pożywkę następnego dnia.
9. Kontynuuj inkubację zrewitalizowanych komórek zgodnie z instrukcjami dla tej konkretnej linii komórkowej.
10. Przed przystąpieniem do eksperymentów należy pozwolić rozmrożonym komórkom na regenerację w podłożu hodowlanym, aby komórki mogły zregenerować się po stresie związanym z rozmrażaniem. Sprawdź również komórki pod kątem uszkodzeń i żywotności poprzez obserwację mikroskopową lub przeprowadzenie testu żywotności i monitoruj wzrost komórek.

Uwaga: Nie zapomnij sprawdzić i ustawić temperatury inkubacji i_{CO2 odpowiednich} dla Twoich komórek! Większość komórek inkubuje się w temperaturze 37 °C, ale niektóre komórki owadów wymagają niższych temperatur.

Dlaczego rozmrażanie jest stresujące dla komórek?

Proces rozmrażania naraża komórki na potencjalnie szkodliwe zmiany środowiskowe opisane poniżej:

• Zmiany temperatury: Komórki mogą zostać uszkodzone podczas przejścia z temperatury kriogenicznej do cieplejszej. Szok termiczny podczas rozmrażania może uszkodzić błony, enzymy i inne komórki.
• Zmiany osmotyczne: Wahania ciśnienia osmotycznego podczas rozmrażania mogą uszkodzić błonę komórkową i inne struktury. Substancje toksyczne mogą dostać się do komórek, które zostały poddane kriokonserwacji przy użyciu DMSO lub glicerolu.
• Usunięcie krioprotektantów: Krioprotektanty są dodawane do komórek przed zamrożeniem, aby zapobiec tworzeniu się kryształów lodu, ale są toksyczne, jeśli nie zostaną usunięte po rozmrożeniu.
• Zmiany pH: Zmiany pH podczas rozmrażania mogą wywierać negatywny wpływ na komórki. Zmiany temperatury lub uwalnianie produktów przemiany materii mogą powodować zmiany pH.
• Naprężenia mechaniczne: Ponieważ komórki są pipetowane i odwirowywane podczas rozmrażania, mogą wystąpić naprężenia mechaniczne. Może to uszkodzić komórki i zmniejszyć ich żywotność.

Rozmrażanie może powodować stres komórek i uszkadzać ich żywotność i funkcje. Krioprotektanty i dobry protokół rozmrażania mogą zminimalizować te uszkodzenia.

5 wskazówek dotyczących skutecznego rozmrażania i ożywiania komórek

1. Stosuj protokół rozmrażania komórek specyficzny dla rodzaju rozmrażanych komórek, taki jak technika powolnego rozmrażania komórek nowotworowych i macierzystych.
2. Ogranicz ekspozycję na wysokie temperatury i wydłużony czas rozmrażania, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia komórek.
3. Podczas rozmrażania i ożywiania należy ostrożnie obchodzić się z komórkami, aby uniknąć ich uszkodzenia.
4. Sprawdź komórki pod kątem uszkodzeń i żywotności oraz śledź ich wzrost przed użyciem ich w eksperymentach.

Należy przestrzegać zalecanych protokołów i wytycznych dotyczących rozmrażania i ożywiania kriokonserwowanych komórek.