Solujen elvyttäminen kryosäilytyksen jälkeen

Soluja, kudoksia ja jopa joitakin lajeja voidaan varastoida pidemmäksi aikaa ja ottaa sitten talteen jatkotutkimuksia varten. Tässä artikkelissa tarkastellaan erilaisia menettelyjä, joita käytetään solujen sulattamiseen kryosäilytyksessä, ja annetaan ohjeita solujen elvyttämiseen ja elinkelpoisuuden varmistamiseen. On kuitenkin tärkeää noudattaa tarkasti soluviljelyn tarjoajan antamia ohjeita.

Keskeiset asiat

• Solujen sulattaminen on tärkeä vaihe kryosäilytysprosessissa, jossa jäädytetyt solut lämmitetään asteittain huoneenlämpötilaan.
• Syöpäsoluja ja kantasoluja sulatettaessa on suositeltavaa sulattaa injektiopullot hitaasti, koska se vähentää soluvaurioiden riskiä.
• Sulatuksen aikana sulatusnopeus, lämpötila ja altistuminen kryosuojakemikaalille ovat kaikki tekijöitä, jotka voivat aiheuttaa soluvaurioita.
• Solujen elvyttäminen edellyttää, että niille annetaan niiden kasvuun tarvitsemia ravintoaineita ja kivennäisaineita.
• Solujen elvyttämisen jälkeen ja ennen niiden käyttämistä kokeissa on tarpeen tarkistaa solujen vaurioituminen ja elinkelpoisuus sekä seurata niiden kasvua ja lisääntymistä.
• Solujen onnistuneen sulattamisen ja elvyttämisen varmistamiseksi on tärkeää noudattaa suositeltuja ohjeita ja protokollia, käsitellä soluja huolellisesti ja pitää tarkkaa kirjanpitoa.

Sulatusprotokolla

1. Sulata soluja nopeasti 37 °C:n vesihauteessa 1-2 minuutin ajan, kunnes kryopulloon on jäänyt vain pieni jäämöhkäle.
   • Tästä eteenpäin kaikki toimenpiteet on suoritettava aseptisissa olosuhteissa.
2. Siirretään kryopullo desinfioituun steriiliin virtauskaappiin.
3. Avaa pullo varovasti ja käytä 2 ml:n serologista pipettiä solujen kokonaismäärän määrittämiseksi mittaamalla soluliuoksen kokonaistilavuus. Poista sitten 20 µl soluja laskentaa varten aliquotiksi.
4. Aseta solususpensio 15 ml:n sentrifugiputkeen, joka sisältää 8 ml elatusainetta (huoneenlämpö).
5. Suspensioi solut varovasti.
6. Sentrifugoi 3 minuuttia 300 x g:n voimakkuudella ja hävitä supernatantti.
   • Sentrifugointivaihe voidaan jättää pois ja solut voidaan sijoittaa soluviljelykolviin välittömästi, mutta varmista, että väliaine vaihdetaan 24 tuntia myöhemmin.
7. Solut sijoitetaan välittömästi 10 ml:aan tuoretta soluviljelyalustaa (joka on esilämmitetty huoneenlämpötilaan tai 37 °C:seen inkubaattorissa), jotta saadaan kasvuravintoaineet ja laimennetaan kryosuoja-aine, kuten DSMO. Kryosuoja-aineena DMSO suojaa soluja jäätymisen aiheuttamilta vaurioilta estämällä jääkiteiden muodostumisen, mutta se voi olla myrkyllistä soluille suurina pitoisuuksina. Kaksi T25-soluviljelypulloa on täytettävä soluilla.
8. Aseta solut inkubaattoriin ja vaihda väliaine seuraavana päivänä.
9. Jatka elvytettyjen solujen inkubointia tämän solulinjan ohjeiden mukaisesti.
10. Ennen kokeiden suorittamista anna sulatettujen solujen toipua kasvatusmediassa, jotta solut voivat toipua sulatusstressistä. Tarkista myös solujen vaurioituminen ja elinkyky mikroskopoimalla tai tekemällä elinkykytesti ja seuraa solujen kasvua.

Huomautus: Älä unohda etsiä ja asettaa soluillesi_sopivaa inkubaatiolämpötilaa ja_{hiilidioksidia} ! Useimpia soluja inkuboidaan 37 °C:ssa, mutta esimerkiksi jotkin hyönteissolut vaativat alhaisempia lämpötiloja.

Miksi sulattaminen on soluille stressaavaa?

Sulatusprosessi altistaa solut mahdollisesti haitallisille ympäristömuutoksille, jotka on kuvattu jäljempänä:

• Lämpötilan muutokset: Solut voivat vahingoittua siirryttäessä kryogeenisestä lämpötilasta lämpimämpään. Lämpöshokki sulatuksen aikana voi vahingoittaa kalvoja, entsyymejä ja muita soluja.
• Osmoottiset muutokset: Osmoottisen paineen vaihtelut sulatuksen aikana voivat vahingoittaa solukalvoa ja muita rakenteita. Myrkyllisiä aineita voi päästä soluihin, jotka on kryosäilytetty DMSO:lla tai glyserolilla.
• Kryosuoja-aineen poistaminen: Kryosuoja-aineita lisätään soluihin ennen pakastamista jääkiteiden muodostumisen estämiseksi, mutta ne ovat myrkyllisiä, jos niitä ei poisteta sulatuksen jälkeen.
• PH:n muutokset: pH:n muutokset sulatuksen aikana voivat rasittaa soluja. Lämpötilan muutokset tai aineenvaihdunnan jätetuotteiden vapautuminen voivat aiheuttaa pH:n muutoksia.
• Mekaaninen stressi: Kun soluja pipetoidaan ja sentrifugoidaan sulatuksen aikana, voi syntyä mekaanista rasitusta. Tämä voi vahingoittaa soluja ja vähentää niiden elinkelpoisuutta.

Sulattaminen voi stressata soluja ja vahingoittaa niiden elinkelpoisuutta ja toimintaa. Kryosuoja-aineet ja hyvä sulatusprotokolla voivat minimoida tämän vahingon.

5 vinkkiä onnistuneeseen solujen sulattamiseen ja elvyttämiseen

1. Käytä solujen sulattamiseen protokollaa, joka vastaa sulatettavien solujen tyyppiä, kuten hidasta sulatustekniikkaa syöpäsoluille ja kantasoluille.
2. Vähennä altistumista korkeille lämpötiloille ja pitkää sulatusaikaa soluvaurioiden riskin minimoimiseksi.
3. Käsittele soluja sulatuksen ja elvytyksen aikana varovasti vaurioiden välttämiseksi.
4. Tarkasta solujen vaurioituminen ja elinkelpoisuus ja seuraa niiden kasvua ennen niiden käyttöä kokeissa.

Noudata suositeltuja protokollia ja ohjeita kryosäilytettyjen solujen sulattamisessa ja elvyttämisessä.