Відновлення клітин після кріоконсервування

Клітини, тканини і навіть деякі види тварин можна зберігати протягом тривалого часу, а потім відновити для подальшого вивчення. У цій статті розглядаються різні процедури, що використовуються для розморожування клітин у кріоконсервації, а також надаються рекомендації щодо пожвавлення та забезпечення життєздатності клітин. Однак важливо чітко дотримуватися інструкцій, наданих постачальником клітинних культур.

Основні висновки

• Розморожування клітин - важливий етап процесу кріоконсервування, який передбачає поступове зігрівання заморожених клітин до кімнатної температури.
• Для розморожування ракових і стовбурових клітин рекомендується розморожувати пробірки повільно, оскільки це знижує ризик пошкодження клітин.
• Під час розморожування швидкість розморожування, температура і вплив кріопротектора є факторами, які можуть спричинити пошкодження клітин.
• Відновлення клітин вимагає забезпечення їх поживними речовинами і мінералами, необхідними для росту.
• Після відродження клітин і перед використанням їх в експериментах необхідно перевірити клітини на наявність пошкоджень і життєздатність, а також простежити за їхнім ростом і проліферацією.
• Для забезпечення успішного розморожування та оживлення клітин важливо дотримуватися рекомендованих інструкцій і протоколів, обережно поводитися з клітинами та вести точний облік.

Протокол розморожування

1. Швидко розморозьте клітини на водяній бані при 37°C протягом 1 - 2 хвилин, поки в кріокамері не залишиться лише невелика крижана грудка.
   • З цього моменту всі процедури повинні виконуватися в асептичних умовах.
2. Перенесіть кріовіал у продезінфіковану стерильну проточну шафу.
3. Обережно відкрийте флакон і за допомогою серологічної піпетки об'ємом 2 мл визначте загальну кількість клітин, вимірявши загальний об'єм клітинного розчину. Потім відберіть 20 мкл клітин для підрахунку аліквоти.
4. Помістіть клітинну суспензію в 15 мл центрифужну пробірку, яка містить 8 мл культурального середовища (кімнатної температури).
5. Обережно підвісьте клітини.
6. Центрифугуйте протягом 3 хвилин при 300 x g і відкиньте надосадову рідину.
   • Етап центрифугування можна пропустити і відразу помістити клітини в колбу з культурою клітин, але не забудьте замінити середовище через 24 години.
7. Негайно помістіть клітини в 10 мл свіжого живильного середовища (попередньо підігрітого до кімнатної температури або 37 °C в інкубаторі), щоб забезпечити їх поживними речовинами і розбавити кріопротектором, наприклад, DSMO. Як кріопротектор, ДМСО захищає клітини від пошкоджень, спричинених заморожуванням, запобігаючи утворенню кристалів льоду, але у високих концентраціях він може бути токсичним для клітин. Дві колби для культивування клітин T25 слід заповнити клітинами.
8. Помістіть клітини в інкубатор і змініть середовище наступного дня.
9. Продовжуйте інкубацію пожвавлених клітин відповідно до інструкцій для цієї конкретної клітинної лінії.
10. Перед виконанням експериментів дайте розмороженим клітинам відновитися в культуральному середовищі, щоб клітини могли оговтатися від стресу, спричиненого розморожуванням. Також перевірте клітини на пошкодження та життєздатність за допомогою мікроскопічного спостереження або тесту на життєздатність і спостерігайте за їхнім ростом.

Примітка: Не забудьте знайти і встановити температуру інкубації та вміст CO2, які_{підходять} для ваших клітин! Більшість клітин інкубують при 37 °C, але деякі клітини комах, наприклад, потребують нижчих температур.

Чому розморожування є стресом для клітин?

Процес розморожування піддає клітини потенційно шкідливим змінам у навколишньому середовищі, як описано нижче:

• Зміни температури: Клітини можуть бути пошкоджені під час переходу від кріогенних до тепліших температур. Термічний шок під час розморожування може пошкодити мембрани, ферменти та інші клітини.
• Осмотичні зміни: Коливання осмотичного тиску під час відтавання можуть пошкодити клітинну мембрану та інші структури. Токсичні речовини можуть потрапляти в клітини, які були кріоконсервовані за допомогою ДМСО або гліцерину.
• Видалення кріопротектора: кріопротектори додають до клітин перед заморожуванням, щоб запобігти утворенню кристалів льоду, але вони токсичні, якщо їх не видалити після відтавання.
• Зміна рН: зміна рН під час розморожування може викликати стрес у клітинах. Зміни температури або виділення продуктів метаболізму можуть спричинити зміни рН.
• Механічний стрес: Під час розморожування, коли клітини піпетують і центрифугують, може виникнути механічний стрес. Це може пошкодити клітини і знизити їх життєздатність.

Розморожування може спричинити стрес для клітин і порушити їхню життєздатність та функції. Кріопротектори і правильний протокол розморожування можуть мінімізувати ці пошкодження.

5 порад для успішного розморожування і відродження клітин

1. Використовуйте протокол для розморожування клітин, специфічний для типу клітин, що розморожуються, наприклад, повільне розморожування для ракових клітин і стовбурових клітин.
2. Зменшіть вплив високих температур і тривалий час розморожування, щоб мінімізувати ризик пошкодження клітин.
3. Під час розморожування і пожвавлення поводьтеся з клітинами обережно, щоб уникнути пошкоджень.
4. Перевіряйте клітини на наявність пошкоджень і життєздатність, а також відстежуйте їхній ріст перед використанням в експериментах.

Дотримуйтесь рекомендованих протоколів та інструкцій для розморожування та оживлення кріоконсервованих клітин.