إحياء الخلايا بعد الحفظ بالتبريد

يمكن تخزين الخلايا والأنسجة وحتى بعض الأنواع لفترة طويلة ثم استعادتها لمزيد من الدراسة. تبحث هذه المقالة في الإجراءات المختلفة المستخدمة لإذابة الخلايا في الحفظ بالتبريد وتقدم إرشادات لإحياء الخلايا وضمان حيويتها. ومع ذلك، من المهم اتباع الإرشادات التي يقدمها مزود مزرعة الخلايا عن كثب.

الوجبات الرئيسية

• تُعد إذابة الخلايا خطوة حاسمة في عملية الحفظ بالتبريد، والتي تنطوي على التسخين التدريجي للخلايا المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة.
• يوصى بإذابة الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية لإذابة الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية ببطء لأن ذلك يقلل من خطر تلف الخلايا.
• أثناء عملية الذوبان، فإن معدل الذوبان ودرجة الحرارة والتعرض لمادة التبريد كلها عوامل يمكن أن تسبب تلف الخلايا.
• يتطلب إحياء الخلايا تزويدها بالعناصر الغذائية والمعادن التي تحتاجها للنمو.
• بعد إعادة إحياء الخلايا وقبل استخدامها في التجارب، من الضروري التحقق من تلف الخلايا وقابليتها للنمو، بالإضافة إلى مراقبة نموها وتكاثرها.
• ولضمان نجاح إذابة الخلايا وإحيائها بنجاح، من الضروري الالتزام بالإرشادات والبروتوكولات الموصى بها، والتعامل مع الخلايا بعناية، والاحتفاظ بسجلات دقيقة.

بروتوكول الإذابة

1. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى لا يتبقى سوى كتلة ثلج صغيرة في القارورة المبردة.
   • من هذه النقطة فصاعدًا، يجب تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة.
2. انقل القارورة المبردة إلى خزانة تدفق معقمة ومعقمة.
3. افتح القارورة بعناية واستخدم ماصة مصلية سعة 2 مل لتحديد العدد الإجمالي للخلايا عن طريق قياس الحجم الكلي لمحلول الخلية. ثم، قم بإزالة 20 ميكرولتر من الخلايا لعدها كقطرات صغيرة.
4. ضع معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 8 مل من وسط المستنبت (درجة حرارة الغرفة).
5. علّق الخلايا بعناية.
6. قم بالطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم وتخلص من المادة الطافية.
   • يمكن حذف خطوة الطرد المركزي ووضع الخلايا في دورق مزرعة الخلايا على الفور، ولكن تأكد من تغيير الوسط بعد 24 ساعة.
7. توضع الخلايا في 10 مل من وسط مزرعة الخلايا الطازجة (يتم تدفئته مسبقًا إلى درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية في حاضنة) على الفور لتوفير مغذيات النمو وتخفيف مادة التبريد، مثل DSMO. يحمي DMSO الخلايا من التلف الناجم عن التجميد باعتباره مادة واقية بالتبريد، وذلك عن طريق منع تكوين بلورات الثلج، ولكنه قد يكون سامًا للخلايا بتركيزات عالية. يجب ملء قارورتي زراعة الخلايا T25 بالخلايا.
8. وضع الخلايا في حاضنة وتغيير الوسط في اليوم التالي.
9. استمر في تحضين الخلايا المعاد تنشيطها حسب التعليمات الخاصة بهذا الخط الخلوي المعين.
10. قبل إجراء التجارب، اسمح للخلايا المُذابة بالتعافي في وسط الاستزراع حتى تتمكن الخلايا من التعافي من إجهاد الذوبان. تحقق أيضًا من تلف الخلايا وقابليتها للحياة عن طريق الملاحظة المجهرية، أو عن طريق إجراء اختبار قابلية الحياة ومراقبة نمو الخلايا.

ملاحظة: لا تنس البحث وضبط درجة حرارة الحضانة وثاني أكسيد الكربون_{المناسبة} لخلاياك! يتم تحضين معظم الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ولكن بعض خلايا الحشرات على سبيل المثال تتطلب درجات حرارة أقل.

لماذا يكون الذوبان مرهقًا للخلايا؟

تعرض عملية الذوبان الخلايا لتغيرات بيئية ضارة محتملة كما هو موضح أدناه:

• تغيرات درجة الحرارة: يمكن أن تتلف الخلايا أثناء الانتقال من درجات الحرارة المبردة إلى درجات حرارة أكثر دفئًا. يمكن أن تؤدي الصدمة الحرارية أثناء الذوبان إلى تلف الأغشية والإنزيمات والخلايا الأخرى.
• التغيرات الأسموزية: يمكن أن تتسبب تقلبات الضغط الأسموزي أثناء الذوبان في تلف غشاء الخلية وغيرها من البنى. يمكن أن تدخل المواد السامة إلى الخلايا التي تم حفظها بالتبريد باستخدام DMSO أو الجلسرين.
• إزالة المواد الواقية بالتبريد: تُضاف المواد الواقية بالتبريد إلى الخلايا قبل التجميد لمنع تكون بلورات الثلج، ولكنها تكون سامة إذا لم تتم إزالتها بعد الذوبان.
• التغيرات في الأس الهيدروجيني: يمكن أن تؤدي التغيراتفي الأس الهيدروجيني أثناء الذوبان إلى إجهاد الخلايا. يمكن أن تسبب التغيرات في درجة الحرارة أو إطلاق الفضلات الأيضية تغيرات في الأس الهيدروجيني.
• الإجهاد الميكانيكي: يمكن أن يحدث إجهاد ميكانيكي أثناء إذابة الجليد أثناء سحب الخلايا وطردها مركزيًا. قد يؤدي ذلك إلى تلف الخلايا ويقلل من قابليتها للحياة.

يمكن أن يؤدي الذوبان إلى إجهاد الخلايا وإتلاف قابليتها للحياة ووظيفتها. يمكن أن تقلل مواد الحماية بالتبريد وبروتوكول الذوبان الجيد من هذا الضرر.

5 نصائح لإذابة الخلايا وإحيائها بنجاح

1. استخدام بروتوكول لإذابة الخلايا خاص بنوع الخلايا التي يتم إذابتها، مثل تقنية الإذابة البطيئة للخلايا السرطانية والخلايا الجذعية.
2. تقليل التعرض لدرجات الحرارة العالية ووقت الذوبان الطويل لتقليل خطر تلف الخلايا.
3. أثناء الذوبان والإحياء، تعامل مع الخلايا بحذر لتجنب التلف.
4. افحص الخلايا للتحقق من تلفها وحيويتها وتتبع نموها قبل استخدامها في التجارب.

الالتزام بالبروتوكولات والإرشادات الموصى بها لإذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد وإحيائها.