凍結保存後の細胞の復活

細胞、組織、そしていくつかの生物種は、長期間保存した後、さらなる研究のために回収することができる。この論文では、凍結保存中の細胞を解凍するために用いられる様々な手順について考察し、細胞を復活させ、生存性を確保するための指針を提供する。ただし、細胞培養を提供している業者の指示に忠実に従うことが重要である。

要点

• 細胞の融解は凍結保存プロセスにおける重要なステップであり、凍結した細胞を徐々に室温まで温めることを含む。
• がん細胞や幹細胞を融解する場合は、バイアルをゆっくりと融解することが推奨されます。
• 解凍中、解凍速度、温度、凍結保護剤への暴露はすべて、細胞損傷の原因となりうる要因である。
• 細胞を復活させるには、成長に必要な栄養素とミネラルを与える必要があります。
• 細胞を復活させた後、実験に使用する前に、細胞の損傷と生存性をチェックし、成長と増殖をモニターする必要がある。
• 細胞の解凍と蘇生を成功させるためには、推奨され るガイドラインとプロトコルを遵守し、細胞を注意深く 取り扱い、正確な記録を保持することが不可欠であ る。

解凍プロトコール

1. 細胞を37℃のウォーターバスで1～2分間、クライオバ イアル内に小さな氷の塊が残る程度まで急速解凍す る。
   • この時点から、すべての処置は無菌条件下で行われなければならない。
2. クライオバイアルを消毒した無菌フローキャビネットに移す。
3. 慎重にバイアルを開け、2mL血清ピペットを用いて細胞溶液の総量を測定し、細胞の総数を決定する。その後、20 µLの細胞をアリコートとして取り出し、計数する。
4. 細胞懸濁液を、8mLの培地（室温）を入れた15mL遠心チューブに入れる。
5. 細胞を注意深く懸濁する。
6. 300×gで3分間遠心し、上清を捨てる。
   • 遠心ステップを省略し、細胞を直ちに細胞培養フラスコに入れ てもよいが、必ず24時間後に培地を交換する。
7. 細胞を10mlの新鮮な細胞培養培地（インキュベーターで室温または37℃に加温済み）に直ちに入れ、増殖栄養分を供給し、DSMOなどの凍結保護剤を希釈する。凍結保護剤として、DMSOは氷晶の形成を防いで凍結による損傷から細胞を保護するが、高濃度では細胞に毒性を示すことがある。T25細胞培養フラスコ2本に細胞を入れる。
8. 細胞をインキュベーターに入れ、翌日培地を交換する。
9. 活性化した細胞を、この特定の細胞株について指示され た通りに培養し続ける。
10. 実験を行う前に、細胞が解凍ストレスから回復できるように、解凍した細胞を培養液中で回復させてください。また、顕微鏡観察、あるいは生存性試験を行って、細胞の損傷と生存性をチェックし、細胞の成長をモニターする。

注意：細胞に適した培養温度と_{CO2を調べて} 設定することを忘れないように！ほとんどの細胞は37℃でインキュベートされるが、昆虫細胞などはより低い温度を必要とするものもある。

なぜ解凍は細胞にストレスを与えるのですか？

解凍の過程で、細胞は以下のような有害な環境変化にさらされる可能性がある：

• 温度変化：温度変化：細胞は、極低温からより高い温度への移行 中にダメージを受ける可能性がある。解凍中の熱ショックは、膜、酵素、その他の細胞を損傷する可能性がある。
• 浸透圧の変化：解凍中の浸透圧の変動は、細胞膜や他の構造を 損なう可能性がある。DMSOやグリセロールで凍結保存された細胞に有毒物質が入り込むことがある。
• 凍結保護剤の除去：凍結保護剤は、氷結晶の形成を防ぐために凍結前に細胞に添加されるが、融解後に除去されないと有毒である。
• pHの変化：融解中のpH変化は細胞にストレスを与える。温度変化や代謝老廃物の放出がpH変化の原因となる。
• 機械的ストレス：解凍中に細胞がピペッティングされたり遠心分離され たりすると、機械的ストレスが生じることがある。これは細胞を損傷し、生存能力を低下させる可能性がある。

融解は細胞にストレスを与え、その生存能と機能を 損なう可能性がある。凍結保護剤と適切な解凍プロトコールにより、このダメージを最小限に抑えることができます。

細胞の解凍と蘇生を成功させるための5つのヒント

1. 癌細胞や幹細胞用の緩徐解凍法など、解凍する細胞のタイプに特化した解凍プロトコルを用いる。
2. 細胞損傷のリスクを最小限にするため、高温への曝露や長時 間の融解を減らす。
3. 解凍と再活性化の際には、細胞の損傷を避けるため に慎重に取り扱う。
4. 実験に使用する前に、細胞の損傷と生存性を検査し、成長を追跡する。

凍結保存された細胞の解凍と復活については、推奨されるプロトコールとガイドラインに従ってください。