Återuppliva celler efter kryopreservering

Celler, vävnader och till och med vissa arter kan förvaras under en längre tid och sedan återvinnas för vidare studier. I den här artikeln beskrivs de olika procedurer som används för att tina upp celler i kryokonservering och ger vägledning för att återuppliva och säkerställa cellernas livskraft. Det är dock viktigt att noga följa de instruktioner som ges av din cellkulturleverantör.

Viktigt att ta med sig

• Upptining av celler är ett viktigt steg i kryopreserveringsprocessen, som innebär att frysta celler gradvis värms upp till rumstemperatur.
• Vid upptining av cancerceller och stamceller rekommenderas att flaskorna tinas långsamt eftersom det minskar risken för cellskador.
• Under upptiningen är upptiningshastigheten, temperaturen och exponeringen för kryoskyddsmedel alla faktorer som kan orsaka cellskador.
• För att återuppliva celler måste de förses med de näringsämnen och mineraler som de behöver för att växa.
• Efter att cellerna har återupplivats och innan de används i experiment måste man kontrollera om de är skadade och livsdugliga samt övervaka deras tillväxt och spridning.
• För att säkerställa framgångsrik upptining och återupplivning av celler är det viktigt att följa rekommenderade riktlinjer och protokoll, hantera cellerna varsamt och föra noggranna register.

Protokoll för upptining

1. Tina cellerna snabbt i ett 37°C vattenbad under 1-2 minuter tills endast en liten isklump finns kvar i kryovialen.
   • Från och med nu måste alla procedurer utföras under aseptiska förhållanden.
2. Överför kryovialen till ett desinficerat sterilt flödesskåp.
3. Öppna flaskan försiktigt och använd en serologisk pipett på 2 ml för att bestämma det totala antalet celler genom att mäta den totala volymen av cellösningen. Ta sedan ut 20 µL celler för räkning som en alikvot.
4. Placera cellsuspensionen i ett 15 ml centrifugrör som innehåller 8 ml odlingsmedium (rumstemperatur).
5. Suspendera cellerna försiktigt.
6. Centrifugera i 3 minuter vid 300 x g och kassera supernatanten.
   • Centrifugeringssteget kan utelämnas och cellerna placeras i en cellodlingskolv omedelbart, men se till att byta medium 24 timmar senare.
7. Placera omedelbart cellerna i 10 ml färskt cellodlingsmedium (förvärmt till rumstemperatur eller 37 °C i en inkubator) för att tillföra tillväxtnäring och späda ut kryoskyddsmedlet, t.ex. DSMO. DMSO är ett kryoskyddsmedel som skyddar cellerna från frysskador genom att förhindra bildandet av iskristaller, men det kan vara giftigt för cellerna i höga koncentrationer. Två T25-cellkulturkolvar ska fyllas med celler.
8. Placera cellerna i en inkubator och byt ut mediet nästa dag.
9. Fortsätt inkubera de återupplivade cellerna enligt anvisningarna för just denna cellinje.
10. Innan du utför dina experiment ska du låta de upptinade cellerna återhämta sig i odlingsmedium så att cellerna kan återhämta sig från upptiningsstressen. Kontrollera också cellerna med avseende på skador och viabilitet genom mikroskopisk observation eller genom att utföra ett viabilitetstest och övervaka cellernas tillväxt.

Obs: Glöm inte att ta reda på och ställa in inkubationstemperatur och_{CO2 som passar} dina celler! De flesta celler inkuberas vid 37 °C, men vissa insektsceller kräver t.ex. lägre temperaturer.

Varför är upptining stressande för cellerna?

Upptiningsprocessen utsätter cellerna för potentiellt skadliga miljöförändringar enligt beskrivningen nedan:

• Temperaturförändringar: Cellerna kan skadas under övergången från kryogena till varmare temperaturer. Termisk chock under upptiningen kan skada membran, enzymer och andra celler.
• Osmotiska förändringar: Fluktuationer i det osmotiska trycket under upptiningen kan skada cellmembranet och andra strukturer. Giftiga ämnen kan tränga in i celler som har kryokonserverats med DMSO eller glycerol.
• Avlägsnande av kryoskyddsmedel: Kryoskyddsmedel tillsätts cellerna före frysning för att förhindra iskristallbildning, men de är giftiga om de inte avlägsnas efter upptining.
• Förändringar ipH: pH-förändringar under upptiningen kan stressa cellerna. Temperaturförändringar eller frisättning av metaboliska avfallsprodukter kan orsaka pH-förändringar.
• Mekanisk stress: När cellerna pipetteras och centrifugeras under upptiningen kan det uppstå mekanisk stress. Detta kan skada cellerna och minska deras livsduglighet.

Upptining kan stressa cellerna och skada deras livskraft och funktion. Kryoprotektanter och ett bra upptiningsprotokoll kan minimera denna skada.

5 tips för framgångsrik upptining och återupplivning av celler

1. Använd ett protokoll för upptining av celler som är specifikt för den typ av celler som ska tinas, t.ex. en långsam upptiningsteknik för cancerceller och stamceller.
2. Minska exponeringen för höga temperaturer och förlängd upptiningstid för att minimera risken för cellskador.
3. Under upptining och återupplivning ska cellerna hanteras varsamt för att undvika skador.
4. Inspektera cellerna med avseende på skador och livskraft och följ deras tillväxt innan du använder dem i experiment.

Följ rekommenderade protokoll och riktlinjer för upptining och återupplivning av kryopreserverade celler.