การฟื้นฟูเซลล์หลังการแช่แข็ง

เซลล์ เนื้อเยื่อ และแม้แต่บางสายพันธุ์สามารถเก็บรักษาไว้เป็นระยะเวลานานและนำกลับมาใช้เพื่อการศึกษาระดับต่อไปได้ บทความนี้จะกล่าวถึงขั้นตอนต่าง ๆ ที่ใช้ในการละลายเซลล์จากการแช่แข็งในกระบวนการเก็บรักษาเซลล์แบบเย็น พร้อมทั้งให้คำแนะนำในการฟื้นฟูและตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ อย่างไรก็ตาม สิ่งสำคัญคือต้องปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ให้บริการเซลล์เพาะเลี้ยงอย่างเคร่งครัด

ประเด็นสำคัญ

• การละลายเซลล์เป็นขั้นตอนสำคัญในกระบวนการแช่แข็งเซลล์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการค่อยๆ อุ่นเซลล์ที่แช่แข็งให้ถึงอุณหภูมิห้อง
• สำหรับการละลายเซลล์มะเร็งและเซลล์ต้นกำเนิด แนะนำให้ละลายขวดช้าๆ เนื่องจากจะช่วยลดความเสี่ยงในการเกิดความเสียหายต่อเซลล์
• ระหว่างการละลายน้ำแข็ง อัตราการละลายน้ำแข็ง อุณหภูมิ และการสัมผัสกับสารป้องกันการแช่แข็ง ล้วนเป็นปัจจัยที่อาจก่อให้เกิดความเสียหายต่อเซลล์ได้
• การฟื้นฟูเซลล์ต้องให้สารอาหารและแร่ธาตุที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตแก่เซลล์
• หลังจากฟื้นฟูเซลล์และก่อนนำไปใช้ในการทดลอง จำเป็นต้องตรวจสอบเซลล์เพื่อหาความเสียหายและความมีชีวิต รวมถึงเฝ้าติดตามการเจริญเติบโตและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ด้วย
• เพื่อให้การละลายน้ำแข็งและการฟื้นฟูเซลล์ประสบความสำเร็จ จำเป็นต้องปฏิบัติตามคำแนะนำและขั้นตอนที่แนะนำอย่างเคร่งครัด จัดการเซลล์อย่างระมัดระวัง และบันทึกข้อมูลอย่างถูกต้อง

ขั้นตอนการละลาย

1. ละลายเซลล์อย่างรวดเร็วในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 – 2 นาที จนเหลือเพียงก้อนน้ำแข็งขนาดเล็กในหลอดแช่แข็ง
   • จากจุดนี้เป็นต้นไป ทุกขั้นตอนจะต้องดำเนินการภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ
2. ย้ายหลอดแช่แข็งไปยังตู้ปลอดเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
3. เปิดขวดอย่างระมัดระวังและใช้ปิเปตซีรั่มขนาด 2 มิลลิลิตรเพื่อวัดปริมาณรวมของเซลล์โดยการวัดปริมาตรรวมของสารละลายเซลล์ จากนั้นนำเซลล์ 20 ไมโครลิตรออกมาเพื่อใช้ในการนับเป็นตัวอย่างแบ่ง
4. นำสารแขวนลอยเซลล์ใส่ลงในหลอดปั่นเหวี่ยงขนาด 15 มิลลิลิตร ที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ 8 มิลลิลิตร (อุณหภูมิห้อง)
5. แขวนเซลล์ด้วยความระมัดระวัง
6. หมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 3 นาที ที่ 300 x g และทิ้งส่วนใส
   • ขั้นตอนการปั่นเหวี่ยงอาจละเว้นได้ และนำเซลล์ไปใส่ในขวดเลี้ยงเซลล์ได้ทันที แต่ต้องเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์ใหม่หลังจากนั้น 24 ชั่วโมง
7. นำเซลล์ไปวางในอาหารเลี้ยงเซลล์สด 10 มิลลิลิตร (อุ่นให้ถึงอุณหภูมิห้องหรือ 37 °C ในตู้อบ) ทันทีเพื่อให้สารอาหารสำหรับการเจริญเติบโตและเจือจางสารป้องกันการแช่แข็ง เช่น DMSO ในฐานะสารป้องกันการแช่แข็ง DMSO จะปกป้องเซลล์จากความเสียหายที่เกิดจากการแช่แข็งโดยป้องกันการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง แต่สามารถเป็นพิษต่อเซลล์เมื่อมีความเข้มข้นสูงควรเติมเซลล์ลงในขวดเพาะเลี้ยงเซลล์ T25 จำนวนสองขวด
8. นำเซลล์ไปไว้ในตู้บ่มเพาะ และเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์ในวันถัดไป
9. ดำเนินการบ่มเซลล์ที่ฟื้นฟูแล้วต่อไปตามคำแนะนำสำหรับสายพันธุ์เซลล์นี้โดยเฉพาะ
10. ก่อนทำการทดลองของคุณ ให้เซลล์ที่ละลายแล้วฟื้นตัวในอาหารเลี้ยงเซลล์เพื่อให้เซลล์สามารถฟื้นตัวจากความเครียดจากการละลายได้ นอกจากนี้ ให้ตรวจสอบเซลล์เพื่อหาความเสียหายและความมีชีวิตโดยการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ หรือโดยการทดสอบความมีชีวิต และติดตามการเจริญเติบโตของเซลล์

หมายเหตุ:อย่าลืมตรวจสอบและตั้งค่าอุณหภูมิการบ่มและ_{ปริมาณ CO2 ที่เหมาะสมกับ} เซลล์ของคุณ! เซลล์ส่วนใหญ่จะบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C แต่เซลล์ของแมลงบางชนิดอาจต้องการอุณหภูมิต่ำกว่านี้

ทำไมการละลายน้ำแข็งจึงสร้างความเครียดให้กับเซลล์?

กระบวนการละลายน้ำแข็งทำให้เซลล์สัมผัสกับการเปลี่ยนแปลงของสิ่งแวดล้อมที่อาจเป็นอันตรายได้ ดังที่อธิบายไว้ด้านล่าง:

• การเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ:เซลล์อาจได้รับความเสียหายระหว่างการเปลี่ยนผ่านจากอุณหภูมิต่ำมาก (เช่น อุณหภูมิเยือกแข็ง) ไปสู่อุณหภูมิที่อุ่นขึ้น การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วระหว่างการละลายน้ำแข็งอาจทำให้เยื่อหุ้มเซลล์ เอนไซม์ และเซลล์อื่น ๆ เสียหายได้
• การเปลี่ยนแปลงทางออสโมซิส:การเปลี่ยนแปลงของความดันออสโมติกในระหว่างการละลายน้ำแข็งสามารถทำลายเยื่อหุ้มเซลล์และโครงสร้างอื่น ๆ ได้ สารพิษสามารถเข้าสู่เซลล์ที่ถูกเก็บรักษาด้วยความเย็นโดยใช้ DMSO หรือกลีเซอรอลได้
• การกำจัดสารป้องกันการแข็งตัว:สารป้องกันการแข็งตัวจะถูกเติมลงในเซลล์ก่อนการแช่แข็งเพื่อป้องกันการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง แต่หากไม่กำจัดออกหลังการละลายแล้ว สารเหล่านี้จะเป็นพิษต่อเซลล์
• การเปลี่ยนแปลงของค่า pH:การเปลี่ยนแปลงของค่า pH ระหว่างการละลายน้ำแข็งสามารถทำให้เซลล์เกิดความเครียดได้ การเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิหรือการปล่อยของเสียจากกระบวนการเมตาบอลิซึมสามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของค่า pH ได้
• ความเค้นเชิงกล:เมื่อเซลล์ถูกดูดด้วยปิเปตและถูกปั่นเหวี่ยงระหว่างการละลายน้ำแข็ง อาจเกิดความเค้นเชิงกลขึ้นได้ ซึ่งอาจทำให้เซลล์เสียหายและลดความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์

การละลายน้ำแข็งสามารถสร้างความเครียดให้กับเซลล์และทำลายความมีชีวิตและการทำงานของพวกมันได้ สารป้องกันการแช่แข็งและขั้นตอนการละลายน้ำแข็งที่ดีสามารถลดความเสียหายนี้ได้

5 เคล็ดลับสำหรับการละลายเซลล์และการฟื้นฟูเซลล์ให้สำเร็จ

1. ใช้โปรโตคอลสำหรับการละลายเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงกับชนิดของเซลล์ที่กำลังละลาย เช่น เทคนิคการละลายช้าสำหรับเซลล์มะเร็งและเซลล์ต้นกำเนิด
2. ลดการสัมผัสกับอุณหภูมิสูงและเวลาการละลายน้ำแข็งที่ยาวนานเพื่อลดความเสี่ยงของการเสียหายของเซลล์
3. ระหว่างการละลายน้ำแข็งและการฟื้นฟู ให้จัดการกับเซลล์อย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหาย
4. ตรวจสอบเซลล์เพื่อหาความเสียหายและความมีชีวิต และติดตามการเจริญเติบโตของเซลล์ก่อนนำไปใช้ในการทดลอง

ปฏิบัติตามขั้นตอนและแนวทางที่แนะนำสำหรับการละลายน้ำแข็งและการฟื้นฟูเซลล์ที่เก็บรักษาด้วยความเย็น