Reavivar células após criopreservação

Células, tecidos e até mesmo algumas espécies podem ser armazenadas durante um período alargado e depois recuperadas para estudo posterior. Este artigo analisa os vários procedimentos utilizados para descongelar células em criopreservação e fornece orientações para reavivar e garantir a viabilidade das células. No entanto, é importante seguir rigorosamente as instruções fornecidas pelo fornecedor da cultura de células.

Principais conclusões

• O descongelamento de células é um passo crucial no processo de criopreservação, que envolve o aquecimento gradual das células congeladas até à temperatura ambiente.
• Para descongelar células cancerígenas e células estaminais, recomenda-se que os frascos sejam descongelados lentamente, uma vez que isso reduz o risco de danos nas células.
• Durante a descongelação, a velocidade de descongelação, a temperatura e a exposição ao crioprotector são factores que podem causar danos nas células.
• A reanimação das células requer o fornecimento dos nutrientes e minerais de que necessitam para o seu crescimento.
• Depois de reavivar as células e antes de as utilizar em experiências, é necessário verificar os danos e a viabilidade das células, bem como monitorizar o seu crescimento e proliferação.
• Para garantir o sucesso da descongelação e reanimação das células, é essencial aderir às diretrizes e protocolos recomendados, manusear as células com cuidado e manter registos precisos.

Protocolo de descongelação

1. Descongelar rapidamente as células num banho de água a 37°C durante 1 a 2 minutos até restar apenas um pequeno pedaço de gelo no criovial.
   • A partir deste ponto, todos os procedimentos devem ser efectuados em condições assépticas.
2. Transferir o frasco criogénico para uma câmara de fluxo estéril higienizada.
3. Abrir cuidadosamente o frasco e utilizar uma pipeta serológica de 2 mL para determinar o número total de células, medindo o volume total da solução celular. Em seguida, retirar 20 µL de células para contagem como uma alíquota.
4. Colocar a suspensão de células num tubo de centrifugação de 15 ml que contenha 8 ml de meio de cultura (temperatura ambiente).
5. Suspender as células com cuidado.
6. Centrifugar durante 3 minutos a 300 x g e deitar fora o sobrenadante.
   • A etapa de centrifugação pode ser omitida e as células podem ser imediatamente colocadas num frasco de cultura de células, mas certifique-se de que muda de meio 24 horas mais tarde.
7. Colocar imediatamente as células em 10 ml de meio de cultura celular fresco (pré-aquecido à temperatura ambiente ou a 37 °C numa incubadora) para fornecer nutrientes de crescimento e diluir o crioprotector, como o DSMO. Como crioprotector, o DMSO protege as células dos danos causados pela congelação, impedindo a formação de cristais de gelo, mas pode ser tóxico para as células em concentrações elevadas. Encher dois frascos de cultura de células T25 com células.
8. Colocar as células numa incubadora e mudar o meio no dia seguinte.
9. Continuar a incubar as células revitalizadas conforme as instruções para esta linha celular específica.
10. Antes de realizar as suas experiências, deixe as células descongeladas recuperarem no meio de cultura para que as células possam recuperar do stress da descongelação. Além disso, verifique os danos e a viabilidade das células por observação microscópica ou através da realização de um teste de viabilidade e monitorize o crescimento das células.

Nota: Não se esqueça de procurar e definir a temperatura de incubação e_{o CO2 adequados} às suas células! A maioria das células é incubada a 37 °C, mas algumas células de insectos, por exemplo, requerem temperaturas mais baixas.

Porque é que a descongelação é stressante para as células?

O processo de descongelação expõe as células a alterações ambientais potencialmente nocivas, conforme descrito abaixo:

• Alterações de temperatura: As células podem ser danificadas durante a transição de temperaturas criogénicas para temperaturas mais quentes. O choque térmico durante a descongelação pode danificar as membranas, as enzimas e outras células.
• Alterações osmóticas: As flutuações da pressão osmótica durante a descongelação podem danificar a membrana celular e outras estruturas. As substâncias tóxicas podem entrar nas células que foram criopreservadas com DMSO ou glicerol.
• Remoção do crioprotector: Os crioprotectores são adicionados às células antes da congelação para evitar a formação de cristais de gelo, mas são tóxicos se não forem removidos após a descongelação.
• Alterações do pH: As alterações do pH durante a descongelação podem provocar stress nas células. As alterações de temperatura ou a libertação de resíduos metabólicos podem causar alterações de pH.
• Stress mecânico: Como as células são pipetadas e centrifugadas durante a descongelação, pode ocorrer stress mecânico. Este facto pode danificar as células e reduzir a sua viabilidade.

O descongelamento pode causar stress nas células e prejudicar a sua viabilidade e função. Os crioprotectores e um bom protocolo de descongelação podem minimizar estes danos.

5 dicas para um descongelamento e reanimação celular bem sucedidos

1. Utilize um protocolo de descongelação de células específico para o tipo de células a descongelar, como uma técnica de descongelação lenta para células cancerígenas e células estaminais.
2. Reduzir a exposição a temperaturas elevadas e o tempo de descongelação prolongado para minimizar o risco de danos nas células.
3. Durante a descongelação e o reavivamento, manusear as células com cuidado para evitar danos.
4. Inspecionar as células quanto a danos e viabilidade e acompanhar o seu crescimento antes de as utilizar em experiências.

Cumpra os protocolos e diretrizes recomendados para descongelar e reavivar células criopreservadas.