החייאת תאים לאחר שימור בקירור

תאים, רקמות ואפילו מינים מסוימים יכולים להיות מאוחסנים לתקופה ממושכת ולאחר מכן לשמש למחקר נוסף. מאמר זה סוקר את ההליכים השונים המשמשים להפשרת תאים בקריופריזציה ומספק הנחיות להחייאה ולהבטחת חיוניות התאים. עם זאת, חשוב להקפיד על ביצוע ההוראות שניתנו על ידי ספק תרבית התאים.

נקודות מרכזיות

• הפשרת תאים היא שלב מכריע בתהליך הקפאה, הכולל חימום הדרגתי של תאים קפואים לטמפרטורת החדר.
• להפשרת תאי סרטן ותאי גזע מומלץ להפשיר את הבקבוקונים לאט, מכיוון שהדבר מפחית את הסיכון לפגיעה בתאים.
• במהלך ההפשרה, קצב ההפשרה, הטמפרטורה והחשיפה לחומר הקריופרוטקטי הם גורמים העלולים לגרום לנזק לתאים.
• החייאת תאים מחייבת לספק להם את החומרים המזינים והמינרלים הדרושים לצמיחתם.
• לאחר החייאת התאים ולפני השימוש בהם בניסויים, יש לבדוק את התאים כדי לוודא שהם לא ניזוקו ושהם חיים, וכן לעקוב אחר צמיחתם והתפשטותם.
• כדי להבטיח הפשרה והחייאה מוצלחות של תאים, יש להקפיד על הנחיות ונהלים מומלצים, לטפל בתאים בזהירות ולנהל רישומים מדויקים.

פרוטוקול הפשרה

1. הפשיר את התאים במהירות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 דקות, עד שנותר רק גוש קרח קטן בקריוביאול
   • מנקודה זו ואילך, יש לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים.
2. העבירו את הקריוביאול לארון זרימה סטרילי ומחוטא.
3. פתחו את הבקבוקון בזהירות והשתמשו בפיפטה סרולוגית של 2 מ"ל כדי לקבוע את המספר הכולל של התאים על ידי מדידת הנפח הכולל של תמיסת התאים. לאחר מכן, הוציאו 20 מיקרוליטר של תאים לספירה כאליקווט.
4. הכניסו את תמיסת התאים לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של מצע תרבית (בטמפרטורת החדר).
5. השרו את התאים בזהירות.
6. סובבו בצנטריפוגה במשך 3 דקות ב-300 x g וזרקו את הנוזל העליון
   • ניתן לדלג על שלב הצנטריפוגה ולהכניס את התאים מיד לצלחת תרבית תאים, אך יש להקפיד להחליף את התרבית כעבור 24 שעות.
7. הכניסו את התאים מיד ל-10 מ"ל של מצע תרבית תאים טרי (שחומם מראש לטמפרטורת החדר או ל-37 °C באינקובטור) כדי לספק חומרי הזנה לצמיחה ולדלל את חומר ההגנה מפני הקפאה, כגון DSMO. כחומר הגנה מפני הקפאה, DMSO מגן על התאים מפני נזק הנגרם מהקפאה על ידי מניעת היווצרות גבישי קרח, אך הוא עלול להיות רעיל לתאים בריכוזים גבוהים. יש למלא שני צלוחיות T25 לתרבית תאים בתאים.
8. הכניסו את התאים לאינקובטור והחליפו את התרבית למחרת.
9. המשך לדגיר את התאים שהוחיו בהתאם להוראות עבור קו תאים זה.
10. לפני ביצוע הניסויים, יש לאפשר לתאים המופשרים להתאושש במדיום התרבית, כדי שהתאים יוכלו להתאושש מהלחץ שנגרם להם מההפשרה. כמו כן, יש לבדוק את התאים לאיתור נזק וחיוניות באמצעות תצפית מיקרוסקופית, או על ידי ביצוע בדיקת חיוניות, ולעקוב אחר צמיחת התאים.

הערה: אל תשכחו לבדוק ולהגדיר את טמפרטורת הדגירה ואת_{רמת ה-CO2 המתאימות} לתאים שלכם! רוב התאים מדוגרים בטמפרטורה של 37 °C, אך תאים מסוימים, כגון תאי חרקים, דורשים טמפרטורות נמוכות יותר.

מדוע ההפשרה גורמת ללחץ לתאים?

תהליך ההפשרה חושף את התאים לשינויים סביבתיים שעלולים להזיק להם, כפי שתואר להלן:

• שינויי טמפרטורה: תאים עלולים להיפגע במעבר מטמפרטורות קריוגניות לטמפרטורות חמות יותר. הלם תרמי במהלך ההפשרה עלול לפגוע בקרומים, באנזימים ובתאים אחרים.
• שינויים אוסמוטיים: תנודות בלחץ האוסמוטי במהלך ההפשרה עלולות לפגוע בקרום התא ובמבנים אחרים. חומרים רעילים עלולים לחדור לתאים שהוקפאו באמצעות DMSO או גליצרול.
• הסרת חומר קריו-מגן: חומרים קריו-מגנים מתווספים לתאים לפני ההקפאה כדי למנוע היווצרות גבישי קרח, אך הם רעילים אם לא מוסרים לאחר ההפשרה.
• שינויים ב-pH: שינויים ב-pH במהלך ההפשרה עלולים לגרום ללחץ על התאים. שינויים בטמפרטורה או שחרור של תוצרי פסולת מטבוליים עלולים לגרום לשינויים ב-pH.
• לחץ מכני: כאשר התאים נשאבים ומסובבים בצנטריפוגה במהלך ההפשרה, עלול להיווצר לחץ מכני. זה עלול לפגוע בתאים ולהפחית את חיוניותם.

ההפשרה עלולה לגרום ללחץ על התאים ולפגוע בכושר ההישרדות ובפונקציונליות שלהם. חומרים קריופרוטקטיים ופרוטוקול הפשרה טוב יכולים למזער נזק זה.

5 טיפים להפשרה והחייאה מוצלחות של תאים

1. השתמש בפרוטוקול להפשרת תאים המתאים לסוג התאים המופשרים, כגון טכניקת הפשרה איטית לתאי סרטן ותאי גזע.
2. הפחיתו את החשיפה לטמפרטורות גבוהות ולזמן הפשרה ממושך כדי למזער את הסיכון לנזק לתאים.
3. במהלך ההפשרה וההחייאה, יש לטפל בתאים בזהירות כדי למנוע נזק.
4. בדקו את התאים כדי לאתר נזק וחיוניות ועקבו אחר צמיחתם לפני השימוש בהם בניסויים.

הקפידו על הפרוטוקולים וההנחיות המומלצים להפשרה והחייאה של תאים שהוקפאו.