Reactivación de células tras la crioconservación

Las células, los tejidos e incluso algunas especies pueden almacenarse durante un periodo prolongado y recuperarse después para estudios posteriores. En este artículo se examinan los distintos procedimientos utilizados para descongelar células en criopreservación y se ofrecen orientaciones para revivirlas y garantizar su viabilidad. No obstante, es importante seguir al pie de la letra las instrucciones del proveedor de cultivos celulares.

Puntos clave

• La descongelación de las células es un paso crucial en el proceso de criopreservación, que implica el calentamiento gradual de las células congeladas hasta alcanzar la temperatura ambiente.
• Para descongelar células cancerosas y células madre se recomienda descongelar los viales lentamente porque reduce el riesgo de daño celular.
• Durante la descongelación, la velocidad de descongelación, la temperatura y la exposición al crioprotector son factores que pueden causar daños celulares.
• Revivir las células requiere proporcionarles los nutrientes y minerales que necesitan para su crecimiento.
• Después de revivir las células y antes de utilizarlas en experimentos, es necesario comprobar si están dañadas y si son viables, así como controlar su crecimiento y proliferación.
• Para garantizar el éxito de la descongelación y reanimación de las células, es esencial seguir las directrices y protocolos recomendados, manipular las células con cuidado y mantener registros precisos.

Protocolo de descongelación

1. Descongelar rápidamente las células en un baño de agua a 37°C durante 1 - 2 minutos hasta que sólo quede un pequeño grumo de hielo en el criovial.
   • A partir de este momento, todos los procedimientos deben realizarse en condiciones asépticas.
2. Transfiera el criovial a una cabina de flujo estéril desinfectada.
3. Abra cuidadosamente el vial y utilice una pipeta serológica de 2 mL para determinar el número total de células midiendo el volumen total de la solución celular. A continuación, extraer 20 µl de células para el recuento como alícuota.
4. Colocar la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 8 ml de medio de cultivo (temperatura ambiente).
5. Suspender las células con cuidado.
6. Centrifugar durante 3 minutos a 300 x g y desechar el sobrenadante.
   • Puede omitirse el paso de centrifugación y colocar las células en un matraz de cultivo celular inmediatamente, pero asegúrese de cambiar el medio 24 horas después.
7. Coloque las células en 10 ml de medio de cultivo celular fresco (precalentado a temperatura ambiente o 37 °C en una incubadora) inmediatamente para proporcionar nutrientes de crecimiento y diluir el crioprotector, como DSMO. Como crioprotector, el DMSO protege a las células de los daños causados por la congelación impidiendo la formación de cristales de hielo, pero puede ser tóxico para las células en concentraciones elevadas. Se llenarán dos matraces de cultivo celular T25 con células.
8. Coloque las células en una incubadora y cambie el medio al día siguiente.
9. Continúe incubando las células revitalizadas como se indica para esta línea celular en particular.
10. Antes de realizar sus experimentos, deje que las células descongeladas se recuperen en medio de cultivo para que las células puedan recuperarse del estrés de la descongelación. Asimismo, compruebe los daños y la viabilidad de las células mediante observación microscópica, o realizando una prueba de viabilidad, y controle el crecimiento de las células.

Nota: ¡No olvide buscar y ajustar la temperatura de incubación y el_CO2 adecuados para sus células! La mayoría de las células se incuban a 37 °C, pero algunas células de insectos, por ejemplo, requieren temperaturas más bajas.

¿Por qué la descongelación es estresante para las células?

El proceso de descongelación expone a las células a cambios ambientales potencialmente perjudiciales, como se describe a continuación:

• Cambios de temperatura: Las células pueden dañarse durante la transición de temperaturas criogénicas a temperaturas más cálidas. El choque térmico durante la descongelación puede dañar las membranas, las enzimas y otras células.
• Cambios osmóticos: Las fluctuaciones de la presión osmótica durante la descongelación pueden dañar la membrana celular y otras estructuras. Las sustancias tóxicas pueden entrar en las células que han sido crioconservadas con DMSO o glicerol.
• Eliminación del crioprotector: Los crioprotectores se añaden a las células antes de la congelación para evitar la formación de cristales de hielo, pero son tóxicos si no se eliminan después de la descongelación.
• Cambiosde pH: Los cambios de pH durante la descongelación pueden estresar a las células. Los cambios de temperatura o la liberación de productos de desecho metabólicos pueden provocar cambios en el pH.
• Estrés mecánico: Al pipetear y centrifugar las células durante la descongelación, puede producirse estrés mecánico. Esto puede dañar las células y reducir su viabilidad.

La descongelación puede estresar las células y dañar su viabilidad y función. Los crioprotectores y un buen protocolo de descongelación pueden minimizar este daño.

5 consejos para descongelar y revivir células con éxito

1. Utilice un protocolo de descongelación de células específico para el tipo de células que se están descongelando, como una técnica de descongelación lenta para células cancerosas y células madre.
2. Reduzca la exposición a altas temperaturas y el tiempo de descongelación prolongado para minimizar el riesgo de daño celular.
3. Durante la descongelación y la reactivación, manipule las células con cuidado para evitar daños.
4. Inspeccione las células en busca de daños y viabilidad y realice un seguimiento de su crecimiento antes de utilizarlas en experimentos.

Siga los protocolos y directrices recomendados para la descongelación y reanimación de células criopreservadas.