Oživljanje celic po kriokonzervaciji

Celice, tkiva in celo nekatere vrste lahko shranimo za daljše obdobje in jih nato obnovimo za nadaljnje študije. V tem članku so predstavljeni različni postopki, ki se uporabljajo za odtaljevanje celic pri kriokonzervaciji, ter navodila za oživljanje in zagotavljanje sposobnosti preživetja celic. Vendar pa je pomembno, da natančno upoštevate navodila, ki vam jih je dal vaš ponudnik celičnih kultur.

Ključne ugotovitve

• Odtajanje celic je ključni korak v postopku kriokonzervacije, ki vključuje postopno segrevanje zamrznjenih celic na sobno temperaturo.
• Pri odmrzovanju rakavih celic in matičnih celic je priporočljivo, da se viale odmrzujejo počasi, saj se tako zmanjša tveganje za poškodbe celic.
• Med odmrzovanjem so hitrost odmrzovanja, temperatura in izpostavljenost krioprotektantu dejavniki, ki lahko povzročijo poškodbe celic.
• Za oživitev celic je treba zagotoviti hranila in minerale, ki jih potrebujejo za rast.
• Po oživitvi celic in pred njihovo uporabo v poskusih je treba preveriti, ali so celice poškodovane in vitalne, ter spremljati njihovo rast in razmnoževanje.
• Da bi zagotovili uspešno odmrzovanje in oživljanje celic, se je treba držati priporočenih smernic in protokolov, s celicami ravnati previdno in voditi natančne evidence.

Protokol odmrzovanja

1. Celice hitro odtajajte v vodni kopeli pri 37 °C 1 do 2 minuti, dokler v kriovialu ne ostane le majhen ledeni skupek.
   • Od te točke naprej je treba vse postopke izvajati v aseptičnih pogojih.
2. Kriovial prenesite v razkuženo sterilno pretočno omaro.
3. Previdno odprite vialo in s serološko pipeto s prostornino 2 ml določite skupno število celic tako, da izmerite skupno prostornino celične raztopine. Nato odvzamemo 20 µL celic za štetje kot alikvot.
4. Celično suspenzijo dajte v 15-mililitrsko centrifugirno epruveto, ki vsebuje 8 ml gojišča (sobna temperatura).
5. Previdno suspendirajte celice.
6. Centrifugirajte 3 minute pri 300 x g in zavrzite supernatant.
   • Korak centrifugiranja lahko izpustite in celice takoj prenesete v bučko za gojenje celic, vendar poskrbite, da po 24 urah zamenjate gojišče.
7. Celice takoj dajte v 10 ml svežega gojišča za celične kulture (predhodno segretega na sobno temperaturo ali 37 °C v inkubatorju), da zagotovite hranila za rast in razredčite krioprotektant, kot je DSMO. DSMO kot krioprotektant ščiti celice pred poškodbami zaradi zamrzovanja, saj preprečuje nastanek ledenih kristalov, vendar je lahko v visokih koncentracijah za celice strupen. S celicami napolnite dve bučki T25 za gojenje celic.
8. Celice postavite v inkubator in naslednji dan zamenjajte gojišče.
9. Nadaljujte z inkubiranjem oživljenih celic po navodilih za to posebno celično linijo.
10. Pred izvajanjem poskusov pustite, da se odmrznjene celice obnovijo v gojišču, da si celice opomorejo od stresa zaradi odmrzovanja. Prav tako z mikroskopskim opazovanjem ali s testom viabilnosti preverite poškodbe in vitalnost celic ter spremljajte rast celic.

Opomba: Ne pozabite poiskati in nastaviti inkubacijske temperature in_{CO2, ki sta primerna za} vaše celice! Večino celic inkubiramo pri 37 °C, vendar nekatere celice žuželk na primer potrebujejo nižje temperature.

Zakaj je odmrzovanje stresno za celice?

Postopek odmrzovanja izpostavlja celice potencialno škodljivim okoljskim spremembam, kot je opisano v nadaljevanju:

• Temperaturne spremembe: Celice se lahko poškodujejo med prehodom iz kriogenih na višje temperature. Toplotni šok med odmrzovanjem lahko poškoduje membrane, encime in druge celice.
• Osmotske spremembe: Osmotska nihanja tlaka med odmrzovanjem lahko poškodujejo celično membrano in druge strukture. Strupene snovi lahko vstopijo v celice, ki so bile kriokonzervirane z DMSO ali glicerolom.
• Odstranitev krioprotektantov: Krioprotektante dodamo celicam pred zamrzovanjem, da bi preprečili nastanek ledenih kristalov, vendar so strupeni, če jih po odmrzovanju ne odstranimo.
• Spremembe pH: Spremembe pH med odtaljevanjem lahko povzročijo stres celic. Temperaturne spremembe ali sproščanje presnovnih odpadkov lahko povzročijo spremembe pH.
• Mehanski stres: Med odmrzovanjem lahko pride do mehanskega stresa, ker celice pipetiramo in centrifugiramo. To lahko poškoduje celice in zmanjša njihovo sposobnost preživetja.

Odmrzovanje lahko povzroči stres celic ter zmanjša njihovo sposobnost preživetja in delovanje. Krioprotektanti in dober protokol odmrzovanja lahko to škodo zmanjšajo.

5 nasvetov za uspešno odmrzovanje in oživljanje celic

1. Uporabite protokol za odmrzovanje celic, ki je specifičen za vrsto celic, ki jih odmrzujete, na primer tehniko počasnega odmrzovanja za rakave in matične celice.
2. Zmanjšajte izpostavljenost visokim temperaturam in podaljšanemu času odmrzovanja, da zmanjšate tveganje poškodb celic.
3. Med odmrzovanjem in oživljanjem s celicami ravnajte previdno, da se izognete poškodbam.
4. Pred uporabo celic v poskusih preverite, ali so poškodovane in vitalne, ter spremljajte njihovo rast.

Upoštevajte priporočene protokole in smernice za odtaljevanje in oživljanje kriokonzerviranih celic.