Phục hồi tế bào sau khi bảo quản lạnh

Tế bào, mô và thậm chí một số loài có thể được bảo quản trong thời gian dài và sau đó được phục hồi để tiếp tục nghiên cứu. Bài viết này trình bày các quy trình khác nhau được sử dụng để rã đông tế bào trong quá trình bảo quản lạnh và cung cấp hướng dẫn về cách phục hồi và đảm bảo tính sống còn của tế bào. Tuy nhiên, điều quan trọng là phải tuân thủ chặt chẽ các hướng dẫn do nhà cung cấp tế bào văn hóa cung cấp.

Điểm chính

• Rã đông tế bào là bước quan trọng trong quá trình bảo quản lạnh, bao gồm việc làm ấm dần các tế bào đông lạnh lên nhiệt độ phòng.
• Đối với việc rã đông tế bào ung thư và tế bào gốc, nên rã đông các ống nghiệm từ từ vì điều này giảm thiểu nguy cơ tổn thương tế bào.
• Trong quá trình rã đông, tốc độ rã đông, nhiệt độ và tiếp xúc với chất bảo vệ đông lạnh đều là các yếu tố có thể gây tổn thương tế bào.
• Quá trình hồi sinh tế bào đòi hỏi phải cung cấp cho chúng các chất dinh dưỡng và khoáng chất cần thiết cho sự phát triển.
• Sau khi phục hồi tế bào và trước khi sử dụng chúng trong thí nghiệm, cần kiểm tra tế bào về tổn thương và khả năng sống sót, cũng như theo dõi sự phát triển và nhân lên của chúng.
• Để đảm bảo quá trình rã đông và phục hồi tế bào thành công, việc tuân thủ các hướng dẫn và quy trình khuyến nghị, xử lý tế bào cẩn thận và duy trì hồ sơ chính xác là điều cần thiết.

Quy trình rã đông

1. Rã đông nhanh các tế bào trong bể nước 37°C trong 1–2 phút cho đến khi chỉ còn một khối băng nhỏ trong ống cryovial
   • Từ thời điểm này trở đi, tất cả các quy trình phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
2. Chuyển ống cryovial vào tủ cấy vô trùng đã được khử trùng.
3. Mở ống cẩn thận và sử dụng ống tiêm huyết thanh 2 mL để xác định tổng số tế bào bằng cách đo thể tích tổng của dung dịch tế bào. Sau đó, lấy 20 µL tế bào để đếm như một phần mẫu.
4. Đặt dung dịch tế bào vào ống ly tâm 15 ml chứa 8 ml môi trường nuôi cấy (nhiệt độ phòng).
5. Lắc nhẹ để tế bào phân tán đều.
6. Ly tâm trong 3 phút ở 300 x g và loại bỏ dịch trên
   • Bước ly tâm có thể được bỏ qua và tế bào có thể được đặt trực tiếp vào bình nuôi cấy tế bào, nhưng hãy đảm bảo thay môi trường sau 24 giờ.
7. Đặt tế bào vào 10 ml môi trường nuôi cấy tế bào tươi (đã được làm ấm đến nhiệt độ phòng hoặc 37 °C trong tủ ấm) ngay lập tức để cung cấp chất dinh dưỡng cho sự phát triển và pha loãng chất bảo vệ đông lạnh, chẳng hạn như DSMO. Với vai trò là chất bảo vệ đông lạnh, DMSO bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do đông lạnh bằng cách ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng, nhưng nó có thể độc hại cho tế bào ở nồng độ cao. Hai bình nuôi cấy tế bào T25 nên được đổ đầy tế bào.
8. Đặt tế bào vào tủ ấm và thay môi trường vào ngày hôm sau.
9. Tiếp tục ủ các tế bào đã hồi sinh theo hướng dẫn dành cho dòng tế bào cụ thể này.
10. Trước khi tiến hành thí nghiệm, hãy để các tế bào đã rã đông phục hồi trong môi trường nuôi cấy để các tế bào có thể phục hồi sau stress do rã đông. Ngoài ra, hãy kiểm tra tế bào về tổn thương và khả năng sống sót bằng quan sát vi thể hoặc thực hiện thử nghiệm khả năng sống sót, và theo dõi sự phát triển của tế bào.

Lưu ý: Đừng quên tra cứu và thiết lập nhiệt độ ủ và_{nồng độ CO2 phù hợp} với tế bào của bạn! Hầu hết các tế bào được ủ ở 37 °C, nhưng một số tế bào côn trùng, ví dụ, yêu cầu nhiệt độ thấp hơn.

Tại sao quá trình rã đông lại gây stress cho tế bào?

Quá trình rã đông khiến tế bào tiếp xúc với những thay đổi môi trường có thể gây hại như mô tả dưới đây:

• Thay đổi nhiệt độ: Tế bào có thể bị hư hỏng trong quá trình chuyển từ nhiệt độ đông lạnh sang nhiệt độ ấm hơn. Sốc nhiệt trong quá trình rã đông có thể gây hư hỏng màng tế bào, enzyme và các cấu trúc khác.
• Thay đổi áp suất thẩm thấu: Sự dao động áp suất thẩm thấu trong quá trình rã đông có thể gây hư hại màng tế bào và các cấu trúc khác. Các chất độc hại có thể xâm nhập vào tế bào đã được bảo quản đông lạnh bằng DMSO hoặc glycerol.
• Loại bỏ chất bảo vệ đông lạnh: Chất bảo vệ đông lạnh được thêm vào tế bào trước khi đông lạnh để ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng, nhưng chúng có thể gây độc nếu không được loại bỏ sau khi rã đông.
• Thay đổi pH: Sự thay đổi pH trong quá trình rã đông có thể gây stress cho tế bào. Sự thay đổi nhiệt độ hoặc sự giải phóng các sản phẩm thải chuyển hóa có thể gây ra sự thay đổi pH.
• Áp lực cơ học: Khi tế bào được pipet và ly tâm trong quá trình rã đông, áp lực cơ học có thể xảy ra. Điều này có thể gây hư hại cho tế bào và làm giảm khả năng sống sót của chúng.

Quá trình rã đông có thể gây stress cho tế bào và làm giảm khả năng sống sót và chức năng của chúng. Chất bảo vệ đông lạnh và một quy trình rã đông tốt có thể giảm thiểu tổn thương này.

5 Mẹo để rã đông và phục hồi tế bào thành công

1. Sử dụng quy trình rã đông phù hợp với loại tế bào đang được rã đông, chẳng hạn như kỹ thuật rã đông chậm cho tế bào ung thư và tế bào gốc.
2. Giảm tiếp xúc với nhiệt độ cao và thời gian rã đông kéo dài để giảm thiểu nguy cơ hư hỏng tế bào.
3. Trong quá trình rã đông và phục hồi, hãy xử lý tế bào cẩn thận để tránh gây tổn thương.
4. Kiểm tra tế bào về tổn thương và khả năng sống sót, đồng thời theo dõi sự phát triển của chúng trước khi sử dụng trong thí nghiệm.

Tuân thủ các quy trình và hướng dẫn được khuyến nghị cho việc rã đông và phục hồi tế bào đông lạnh.