Publicado: 2023 | Última revisão: maio de 2026

Revitalização de células após criopreservação

Células, tecidos e até mesmo algumas espécies podem ser armazenados por um longo período e, posteriormente, recuperados para estudos adicionais. Este artigo aborda os diversos procedimentos utilizados para descongelar células em criopreservação e oferece orientações para reativá-las e garantir sua viabilidade. No entanto, é importante seguir rigorosamente as instruções fornecidas pelo seu fornecedor de cultura celular.

Pontos-chave

• O descongelamento de células é uma etapa crucial no processo de criopreservação, que envolve o aquecimento gradual das células congeladas até a temperatura ambiente.
• Para descongelar células cancerosas e células-tronco, recomenda-se descongelar os frascos lentamente, pois isso reduz o risco de danos às células.
• Durante o descongelamento, a taxa de descongelamento, a temperatura e a exposição ao crioprotetor são fatores que podem causar danos às células.
• A reativação das células requer o fornecimento dos nutrientes e minerais necessários para o seu crescimento.
• Após a reativação das células e antes de utilizá-las em experimentos, é necessário verificar se há danos e avaliar a viabilidade das células, bem como monitorar seu crescimento e proliferação.
• Para garantir o sucesso do descongelamento e da reativação das células, é essencial seguir as diretrizes e protocolos recomendados, manusear as células com cuidado e manter registros precisos.

Protocolo de descongelamento

1. Descongele rapidamente as células em um banho-maria a 37 °C por 1 a 2 minutos, até que reste apenas um pequeno pedaço de gelo no criotubo.
   • A partir desse momento, todos os procedimentos devem ser realizados em condições assépticas.
2. Transfira o criotubo para uma cabine de fluxo estéril e higienizada.
3. Abra o frasco com cuidado e use uma pipeta serológica de 2 mL para determinar o número total de células, medindo o volume total da solução celular. Em seguida, retire 20 µL de células para contagem como uma alíquota.
4. Coloque a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 8 ml de meio de cultura (temperatura ambiente).
5. Suspenda as células com cuidado.
6. Centrifugue por 3 minutos a 300 x g e descarte o sobrenadante.
   • A etapa de centrifugação pode ser omitida e as células colocadas imediatamente em um frasco de cultura celular, mas certifique-se de trocar o meio 24 horas depois.
7. Coloque as células imediatamente em 10 ml de meio de cultura celular fresco (pré-aquecido à temperatura ambiente ou a 37 °C em uma incubadora) para fornecer nutrientes para o crescimento e diluir o crioprotetor, como o DMSO. Como crioprotetor, o DMSO protege as células contra danos causados pelo congelamento, impedindo a formação de cristais de gelo, mas pode ser tóxico para as células em altas concentrações. Dois frascos de cultura celular T25 devem ser preenchidos com células.
8. Coloque as células em uma incubadora e troque o meio no dia seguinte.
9. Continue incubando as células revitalizadas conforme as instruções específicas para essa linhagem celular.
10. Antes de realizar seus experimentos, deixe as células descongeladas se recuperarem no meio de cultura para que possam se recuperar do estresse causado pelo descongelamento. Além disso, verifique se há danos e avalie a viabilidade das células por meio de observação microscópica ou realizando um teste de viabilidade, e monitore o crescimento das células.

Observação: Não se esqueça de verificar e definir a temperatura de incubação e o nível de CO₂ adequados para suas células! A maioria das células é incubada a 37 °C, mas algumas células de insetos, por exemplo, requerem temperaturas mais baixas.

Por que o descongelamento é estressante para as células?

O processo de descongelamento expõe as células a mudanças ambientais potencialmente prejudiciais, conforme descrito abaixo:

• Alterações de temperatura: as células podem ser danificadas durante a transição de temperaturas criogênicas para temperaturas mais elevadas. O choque térmico durante o descongelamento pode danificar membranas, enzimas e outras estruturas celulares.
• Alterações osmóticas: as flutuações da pressão osmótica durante o descongelamento podem danificar a membrana celular e outras estruturas. Substâncias tóxicas podem entrar nas células que foram criopreservadas com DMSO ou glicerol.
• Remoção do crioprotetor: Os crioprotetores são adicionados às células antes do congelamento para impedir a formação de cristais de gelo, mas são tóxicos se não forem removidos após o descongelamento.
• Alterações no pH: as alterações no pH durante o descongelamento podem causar estresse nas células. Variações de temperatura ou a liberação de resíduos metabólicos podem causar alterações no pH.
• Estresse mecânico: Como as células são pipetadas e centrifugadas durante o descongelamento, pode ocorrer estresse mecânico. Isso pode danificar as células e reduzir sua viabilidade.

O descongelamento pode causar estresse nas células e prejudicar sua viabilidade e função. Crioprotetores e um bom protocolo de descongelamento podem minimizar esses danos.

5 dicas para o descongelamento e reativação bem-sucedidos de células

1. Utilize um protocolo de descongelamento específico para o tipo de células a ser descongelado, como uma técnica de descongelamento lento para células cancerosas e células-tronco.
2. Reduza a exposição a altas temperaturas e o tempo prolongado de descongelamento para minimizar o risco de danos às células.
3. Durante o descongelamento e a reativação, manuseie as células com cuidado para evitar danos.
4. Inspecione as células quanto a danos e viabilidade e acompanhe seu crescimento antes de utilizá-las em experimentos.

Siga os protocolos e diretrizes recomendados para o descongelamento e a reativação de células criopreservadas.