Šūnu atdzīvināšana pēc kriokonservēšanas

Šūnas, audus un pat dažas sugas var uzglabāt ilgāku laiku un pēc tam atjaunot turpmākai izpētei. Šajā rakstā aplūkotas dažādas procedūras, ko izmanto šūnu atkausēšanai kriokonservēšanas procesā, un sniegti norādījumi šūnu atdzīvināšanai un dzīvotspējas nodrošināšanai. Tomēr ir svarīgi rūpīgi ievērot šūnu kultūru piegādātāja norādījumus.

Galvenie secinājumi

• Šūnu atkausēšana ir būtisks solis kriokonservēšanas procesā, kas ietver pakāpenisku sasaldēto šūnu sasilšanu līdz istabas temperatūrai.
• Atkausējot vēža šūnas un cilmes šūnas, ieteicams atkausēt flakonus lēni, jo tas samazina šūnu bojājumu risku.
• Atkausēšanas laikā atkausēšanas ātrums, temperatūra un krioprotektanta iedarbība ir faktori, kas var izraisīt šūnu bojājumus.
• Lai atdzīvinātu šūnas, tām jānodrošina augšanai nepieciešamās barības vielas un minerālvielas.
• Pēc šūnu atdzīvināšanas un pirms to izmantošanas eksperimentos ir jāpārbauda, vai šūnas nav bojātas un dzīvotspējīgas, kā arī jāuzrauga to augšana un vairošanās.
• Lai nodrošinātu veiksmīgu šūnu atkausēšanu un atdzīvināšanu, ir svarīgi ievērot ieteiktās vadlīnijas un protokolus, uzmanīgi rīkoties ar šūnām un veikt precīzu uzskaiti.

Atkausēšanas protokols

1. Ātri atkausējiet šūnas 37 °C ūdens vannā 1 - 2 minūtes, līdz kriovialā paliek tikai neliels ledus gabaliņš.
   • No šī brīža visas procedūras jāveic aseptiskos apstākļos.
2. Pārnesiet kriovialu uz dezinficētu sterilu plūsmas skapi.
3. Uzmanīgi atveriet flakonu un ar 2 ml seroloģisko pipeti nosakiet kopējo šūnu skaitu, izmērot kopējo šūnu šķīduma tilpumu. Pēc tam paņem 20 µl šūnu skaitīšanai kā alikvotu daļu.
4. Ievietot šūnu suspensiju 15 ml centrifūgas mēģenē, kurā ir 8 ml barotnes (istabas temperatūrā).
5. Uzmanīgi suspendējiet šūnas.
6. Centrifugēt 3 minūtes ar 300 x g un izmest virskārtu.
   • Centrifugēšanas posmu var izlaist un šūnas uzreiz ievietot šūnu kultūras kolbā, bet pēc 24 stundām pārliecinieties, ka ir nomainīta barotne.
7. Šūnas nekavējoties ievieto 10 ml svaigas šūnu barotnes (iepriekš uzsildītas līdz istabas temperatūrai vai 37 °C inkubatorā), lai nodrošinātu augšanas barības vielas un atšķaidītu krioprotektoru, piemēram, DSMO. Kā krioprotektors DSMO aizsargā šūnas no sasalšanas izraisītiem bojājumiem, novēršot ledus kristālu veidošanos, taču tas var būt toksisks šūnām, ja tā koncentrācija ir augsta. Ar šūnām jāpiepilda divas T25 šūnu kultūru kolbas.
8. Ievietot šūnas inkubatorā un nākamajā dienā nomainīt barotni.
9. Turpināt inkubēt atdzīvinātās šūnas saskaņā ar norādījumiem, kas attiecas uz šo konkrēto šūnu līniju.
10. Pirms eksperimentu veikšanas ļaujiet atkausētajām šūnām atdzimt barotnē, lai šūnas varētu atgūties no atkausēšanas stresa. Turklāt pārbaudiet šūnu bojājumus un dzīvotspēju, veicot mikroskopisku novērošanu vai dzīvotspējas testu, un novērojiet šūnu augšanu.

Piezīme: Neaizmirstiet noskaidrot un iestatīt savām šūnām_piemērotu inkubācijas temperatūru un_CO2 ! Lielāko daļu šūnu inkubē 37 °C temperatūrā, bet dažām kukaiņu šūnām, piemēram, nepieciešama zemāka temperatūra.

Kāpēc atkausēšana rada stresu šūnām?

Atkausēšanas procesā šūnas tiek pakļautas potenciāli kaitīgām vides izmaiņām, kā aprakstīts turpmāk:

• Temperatūras izmaiņas: Šūnas var tikt bojātas, pārejot no kriogēnas uz augstāku temperatūru. Termiskais šoks atkausēšanas laikā var bojāt membrānas, fermentus un citas šūnas.
• Osmotiskās izmaiņas: Osmotiskā spiediena svārstības atkausēšanas laikā var bojāt šūnu membrānu un citas struktūras. Toksiskas vielas var iekļūt šūnās, kas ir kriokonservētas ar DMSO vai glicerīnu.
• Krioprotektoru noņemšana: pirms sasaldēšanas šūnām pievieno krioprotektorus, lai novērstu ledus kristālu veidošanos, bet tie ir toksiski, ja netiek noņemti pēc atkausēšanas.
• PH izmaiņas: pH izmaiņas atkausēšanas laikā var radīt stresu šūnām. Temperatūras izmaiņas vai vielmaiņas atkritumproduktu izdalīšanās var izraisīt pH izmaiņas.
• Mehānisks stress: Atkausēšanas laikā šūnas tiek pipetētas un centrifugētas, tāpēc var rasties mehānisks stress. Tas var bojāt šūnas un samazināt to dzīvotspēju.

Atkausēšana var radīt stresu šūnām un kaitēt to dzīvotspējai un funkcijām. Krioprotektori un labs atkausēšanas protokols var mazināt šo bojājumu.

5 padomi veiksmīgai šūnu atkausēšanai un atdzīvināšanai

1. Izmantojiet šūnu atkausēšanas protokolu, kas raksturīgs atkausējamo šūnu tipam, piemēram, lēnas atkausēšanas metodi vēža šūnām un cilmes šūnām.
2. Samaziniet augstu temperatūru un pagarinātu atkausēšanas laiku, lai līdz minimumam samazinātu šūnu bojājumu risku.
3. Atkausēšanas un atdzīvināšanas laikā ar šūnām jārīkojas uzmanīgi, lai izvairītos no bojājumiem.
4. Pirms šūnu izmantošanas eksperimentos pārbaudiet, vai tās nav bojātas un dzīvotspējīgas, un sekojiet to augšanai.

Ievērojiet ieteiktos protokolus un vadlīnijas kriokonservēto šūnu atkausēšanai un atdzīvināšanai.