Rivivere le cellule dopo la crioconservazione

Cellule, tessuti e persino alcune specie possono essere conservati per un lungo periodo e poi recuperati per ulteriori studi. Questo articolo esamina le varie procedure utilizzate per lo scongelamento delle cellule in crioconservazione e fornisce indicazioni per rianimare e garantire la vitalità delle cellule. Tuttavia, è importante seguire attentamente le istruzioni fornite dal fornitore di colture cellulari.

Punti di forza

• Lo scongelamento delle cellule è una fase cruciale del processo di crioconservazione, che prevede il riscaldamento graduale delle cellule congelate a temperatura ambiente.
• Per lo scongelamento di cellule tumorali e staminali si raccomanda di scongelare le fiale lentamente, in quanto si riduce il rischio di danni alle cellule.
• Durante lo scongelamento, la velocità di scongelamento, la temperatura e l'esposizione al crioprotettore sono tutti fattori che possono causare danni alle cellule.
• Per rianimare le cellule è necessario fornire loro i nutrienti e i minerali di cui hanno bisogno per crescere.
• Dopo aver rianimato le cellule e prima di utilizzarle negli esperimenti, è necessario controllare che non siano danneggiate e che non siano vitali, nonché monitorare la loro crescita e proliferazione.
• Per garantire il successo dello scongelamento e della rivitalizzazione delle cellule, è essenziale attenersi alle linee guida e ai protocolli raccomandati, maneggiare le cellule con cura e mantenere registri accurati.

Protocollo di scongelamento

1. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37°C per 1-2 minuti, fino a quando nella crioviale rimane solo un piccolo grumo di ghiaccio.
   • Da questo momento in poi, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni asettiche.
2. Trasferire la crioviale in un armadio a flusso sterile sanificato.
3. Aprire con cautela la fiala e utilizzare una pipetta sierologica da 2 mL per determinare il numero totale di cellule misurando il volume totale della soluzione cellulare. Prelevare quindi 20 µL di cellule per il conteggio come aliquota.
4. Mettere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 8 ml di terreno di coltura (temperatura ambiente).
5. Sospendere le cellule con cura.
6. Centrifugare per 3 minuti a 300 x g e scartare il surnatante.
   • La fase di centrifugazione può essere omessa e le cellule possono essere poste immediatamente in una fiasca di coltura, ma assicurarsi di cambiare il terreno di coltura 24 ore dopo.
7. Porre immediatamente le cellule in 10 ml di terreno di coltura fresco (preriscaldato a temperatura ambiente o a 37 °C in un incubatore) per fornire nutrienti per la crescita e diluire il crioprotettore, come il DSMO. Come crioprotettore, il DMSO protegge le cellule dai danni causati dal congelamento impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio, ma può essere tossico per le cellule ad alte concentrazioni. Riempire due fiasche di coltura T25 con le cellule.
8. Mettere le cellule in un incubatore e cambiare il terreno di coltura il giorno successivo.
9. Continuare a incubare le cellule rivitalizzate come indicato per questa particolare linea cellulare.
10. Prima di eseguire gli esperimenti, lasciar riposare le cellule scongelate nel terreno di coltura, in modo che possano riprendersi dallo stress da scongelamento. Inoltre, controllare che le cellule non siano danneggiate e vitali al microscopio o con un test di vitalità e monitorare la crescita delle cellule.

Nota: non dimenticate di cercare e impostare la temperatura di incubazione e la_{CO2 adatte} alle vostre cellule! La maggior parte delle cellule viene incubata a 37 °C, ma alcune cellule di insetti, ad esempio, richiedono temperature più basse.

Perché lo scongelamento è stressante per le cellule?

Il processo di scongelamento espone le cellule a cambiamenti ambientali potenzialmente dannosi, come descritto di seguito:

• Cambiamenti di temperatura: Le cellule possono essere danneggiate durante il passaggio da temperature criogeniche a temperature più calde. Lo shock termico durante lo scongelamento può danneggiare membrane, enzimi e altre cellule.
• Cambiamenti osmotici: Le fluttuazioni della pressione osmotica durante lo scongelamento possono danneggiare la membrana cellulare e altre strutture. Le sostanze tossiche possono entrare nelle cellule crioconservate con DMSO o glicerolo.
• Rimozione del crioprotettore: i crioprotettori vengono aggiunti alle cellule prima del congelamento per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio, ma sono tossici se non vengono rimossi dopo lo scongelamento.
• Variazioni di pH: le variazioni di pH durante lo scongelamento possono stressare le cellule. Gli sbalzi di temperatura o il rilascio di prodotti di scarto del metabolismo possono causare variazioni del pH.
• Stress meccanico: Quando le cellule vengono pipettate e centrifugate durante lo scongelamento, si può verificare uno stress meccanico. Questo può danneggiare le cellule e ridurne la vitalità.

Lo scongelamento può stressare le cellule e danneggiarne la vitalità e la funzione. I crioprotettori e un buon protocollo di scongelamento possono ridurre al minimo questi danni.

5 consigli per il successo dello scongelamento e della rianimazione delle cellule

1. Utilizzare un protocollo di scongelamento delle cellule specifico per il tipo di cellule da scongelare, ad esempio una tecnica di scongelamento lento per le cellule tumorali e le cellule staminali.
2. Ridurre l'esposizione a temperature elevate e a tempi di scongelamento prolungati per minimizzare il rischio di danni alle cellule.
3. Durante lo scongelamento e il risveglio, maneggiare le cellule con cura per evitare danni.
4. Ispezionare le cellule per verificarne i danni e la vitalità e monitorare la loro crescita prima di utilizzarle negli esperimenti.

Attenersi ai protocolli e alle linee guida raccomandati per lo scongelamento e la riattivazione delle cellule crioconservate.