Gjenopplive celler etter kryopreservering

Celler, vev og til og med noen arter kan oppbevares i en lengre periode og deretter hentes ut for videre studier. Denne artikkelen tar for seg de ulike prosedyrene som brukes for tining av celler i kryopreservering, og gir veiledning for gjenoppliving og sikring av cellenes levedyktighet. Det er imidlertid viktig å følge instruksjonene fra leverandøren av cellekulturer nøye.

Viktige poenger

• Opptining av celler er et avgjørende trinn i kryopreserveringsprosessen, som innebærer gradvis oppvarming av frosne celler til romtemperatur.
• Ved tining av kreftceller og stamceller anbefales det å tine flaskene sakte fordi det reduserer risikoen for celleskade.
• Under tining er tinehastighet, temperatur og eksponering for kryobeskyttende middel faktorer som kan forårsake celleskade.
• For å gjenopplive celler må de tilføres de næringsstoffene og mineralene de trenger for å vokse.
• Etter at cellene er gjenopplivet og før de brukes i eksperimenter, er det nødvendig å kontrollere cellene for skader og levedyktighet, samt overvåke vekst og spredning.
• For å sikre vellykket tining og gjenoppliving av celler er det viktig å følge anbefalte retningslinjer og protokoller, håndtere cellene med forsiktighet og føre nøyaktige journaler.

Opptiningsprotokoll

1. Tine cellene raskt i et vannbad på 37 °C i 1-2 minutter til det bare er en liten isklump igjen i kryovialet.
   • Fra dette tidspunktet må alle prosedyrer utføres under aseptiske forhold.
2. Overfør kryoflasken til et desinfisert sterilt flytskap.
3. Åpne hetteglasset forsiktig, og bruk en 2 ml serologisk pipette til å bestemme det totale antallet celler ved å måle det totale volumet av celleløsningen. Ta deretter ut 20 µl av cellene som en alikvote for telling.
4. Plasser cellesuspensjonen i et 15 ml sentrifugerør som inneholder 8 ml dyrkingsmedium (romtemperatur).
5. Suspender cellene med forsiktighet.
6. Sentrifuger i 3 minutter ved 300 x g, og kast supernatanten.
   • Sentrifugeringstrinnet kan utelates, og cellene kan plasseres i en cellekulturkolbe umiddelbart, men sørg for å skifte medium 24 timer senere.
7. Plasser cellene i 10 ml ferskt celledyrkningsmedium (forvarmet til romtemperatur eller 37 °C i en inkubator) umiddelbart for å tilføre vekstnæring og fortynne kryobeskyttelsesmiddelet, for eksempel DSMO. Som kryobeskyttende middel beskytter DMSO cellene mot fryseskade ved å forhindre dannelsen av iskrystaller, men det kan være giftig for cellene i høye konsentrasjoner. To T25-cellekulturkolber skal fylles med celler.
8. Plasser cellene i en inkubator, og bytt medium neste dag.
9. Fortsett å inkubere de revitaliserte cellene som beskrevet for akkurat denne cellelinjen.
10. La de opptinte cellene komme seg i dyrkingsmedium før du utfører eksperimentene, slik at cellene kan komme seg etter tinespenningen. Kontroller også cellene for skader og levedyktighet ved hjelp av mikroskopisk observasjon eller ved å utføre en levedyktighetstest, og overvåk cellenes vekst.

Merk: Ikke glem å slå opp og stille inn inkubasjonstemperatur og_{CO2 som passer} til cellene dine! De fleste celler inkuberes ved 37 °C, men noen insektceller krever for eksempel lavere temperaturer.

Hvorfor er tining stressende for cellene?

Opptiningsprosessen utsetter cellene for potensielt skadelige miljøforandringer som beskrevet nedenfor:

• Temperaturendringer: Celler kan skades under overgangen fra kryogene til varmere temperaturer. Termisk sjokk under tining kan skade membraner, enzymer og andre celler.
• Osmotiske endringer: Osmotiske trykkvariasjoner under tining kan skade cellemembranen og andre strukturer. Giftige stoffer kan trenge inn i celler som har blitt kryopreservert med DMSO eller glyserol.
• Fjerning av kryobeskyttende midler: Kryobeskyttende midler tilsettes cellene før frysing for å forhindre dannelse av iskrystaller, men de er giftige hvis de ikke fjernes etter tining.
• Endringer ipH-verdien: pH-endringer under tining kan stresse cellene. Temperaturendringer eller frigjøring av metabolske avfallsprodukter kan forårsake pH-endringer.
• Mekanisk stress: Når celler pipetteres og sentrifugeres under opptining, kan det oppstå mekanisk stress. Dette kan skade cellene og redusere deres levedyktighet.

Tining kan stresse cellene og skade deres levedyktighet og funksjon. Kryobeskyttende midler og en god tineprotokoll kan minimere denne skaden.

5 tips for vellykket tining og gjenoppliving av celler

1. Bruk en tineprotokoll som er spesifikk for den typen celler som skal tines, for eksempel en langsom tineteknikk for kreftceller og stamceller.
2. Reduser eksponeringen for høye temperaturer og forlenget tinetid for å minimere risikoen for celleskade.
3. Håndter cellene med forsiktighet under tining og gjenoppliving for å unngå skade.
4. Undersøk cellene for skader og levedyktighet, og følg med på veksten før du bruker dem i eksperimenter.

Følg anbefalte protokoller og retningslinjer for tining og gjenoppliving av kryopreserverte celler.