Réanimation des cellules après cryoconservation

Les cellules, les tissus et même certaines espèces peuvent être stockés pendant une période prolongée, puis récupérés en vue d'une étude ultérieure. Cet article examine les différentes procédures utilisées pour décongeler les cellules en cryoconservation et fournit des conseils pour les faire revivre et garantir leur viabilité. Toutefois, il est important de suivre de près les instructions données par votre fournisseur de culture cellulaire.

Principaux enseignements

• La décongélation des cellules est une étape cruciale du processus de cryoconservation, qui implique le réchauffement progressif des cellules congelées jusqu'à la température ambiante.
• Pour la décongélation des cellules cancéreuses et des cellules souches, il est recommandé de décongeler les flacons lentement afin de réduire le risque de dommages cellulaires.
• Pendant la décongélation, la vitesse de décongélation, la température et l'exposition au cryoprotecteur sont autant de facteurs qui peuvent endommager les cellules.
• Pour faire revivre les cellules, il faut leur apporter les nutriments et les minéraux nécessaires à leur croissance.
• Après avoir ranimé les cellules et avant de les utiliser dans des expériences, il est nécessaire de vérifier qu'elles ne sont pas endommagées et viables, et de contrôler leur croissance et leur prolifération.
• Pour garantir la réussite de la décongélation et de la réanimation des cellules, il est essentiel de respecter les lignes directrices et les protocoles recommandés, de manipuler les cellules avec précaution et de tenir des registres précis.

Protocole de décongélation

1. Décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie à 37°C pendant 1 à 2 minutes jusqu'à ce qu'il ne reste plus qu'un petit amas de glace dans le cryovial.
   • À partir de ce moment, toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions d'asepsie.
2. Transférer le cryovial dans une enceinte stérile aseptisée.
3. Ouvrir soigneusement le flacon et utiliser une pipette sérologique de 2 ml pour déterminer le nombre total de cellules en mesurant le volume total de la solution cellulaire. Prélever ensuite 20 µl de cellules pour le comptage en tant qu'aliquote.
4. Placer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture (température ambiante).
5. Suspendre les cellules avec précaution.
6. Centrifuger pendant 3 minutes à 300 x g et jeter le surnageant.
   • L'étape de centrifugation peut être omise et les cellules peuvent être placées immédiatement dans un flacon de culture cellulaire, mais il faut veiller à changer de milieu 24 heures plus tard.
7. Placer immédiatement les cellules dans 10 ml de milieu de culture cellulaire frais (préchauffé à température ambiante ou à 37 °C dans un incubateur) pour fournir des nutriments de croissance et diluer le cryoprotecteur, tel que le DSMO. En tant que cryoprotecteur, le DMSO protège les cellules des dommages causés par la congélation en empêchant la formation de cristaux de glace, mais il peut être toxique pour les cellules à des concentrations élevées. Deux flacons de culture cellulaire T25 doivent être remplis de cellules.
8. Placez les cellules dans un incubateur et changez le milieu le lendemain.
9. Continuez à incuber les cellules revitalisées comme indiqué pour cette lignée cellulaire particulière.
10. Avant de réaliser vos expériences, laissez les cellules décongelées se rétablir dans le milieu de culture afin qu'elles puissent se remettre du stress de la décongélation. Vérifiez également que les cellules ne sont pas endommagées et viables en les observant au microscope ou en effectuant un test de viabilité, et surveillez la croissance des cellules.

Remarque : n'oubliez pas de rechercher et de régler la température d'incubation et le_{taux de CO2 adaptés} à vos cellules ! La plupart des cellules sont incubées à 37 °C, mais certaines cellules d'insectes, par exemple, nécessitent des températures plus basses.

Pourquoi la décongélation est-elle stressante pour les cellules ?

Le processus de décongélation expose les cellules à des changements environnementaux potentiellement nocifs, décrits ci-dessous :

• Changements de température : Les cellules peuvent être endommagées lors du passage d'une température cryogénique à une température plus chaude. Le choc thermique pendant la décongélation peut endommager les membranes, les enzymes et d'autres cellules.
• Changements osmotiques : Les fluctuations de la pression osmotique pendant la décongélation peuvent endommager la membrane cellulaire et d'autres structures. Des substances toxiques peuvent pénétrer dans les cellules qui ont été cryoconservées avec du DMSO ou du glycérol.
• Retrait du cryoprotecteur : des cryoprotecteurs sont ajoutés aux cellules avant la congélation pour empêcher la formation de cristaux de glace, mais ils sont toxiques s'ils ne sont pas retirés après la décongélation.
• Changements de pH : les changements de pH pendant la décongélation peuvent stresser les cellules. Les changements de température ou la libération de déchets métaboliques peuvent entraîner des modifications du pH.
• Stress mécanique : Les cellules étant pipetées et centrifugées pendant la décongélation, un stress mécanique peut se produire. Cela peut endommager les cellules et réduire leur viabilité.

La décongélation peut stresser les cellules et endommager leur viabilité et leur fonction. Les cryoprotecteurs et un bon protocole de décongélation peuvent minimiser ces dommages.

5 conseils pour une décongélation et une reviviscence cellulaires réussies

1. Utiliser un protocole de décongélation des cellules spécifique au type de cellules décongelées, comme une technique de décongélation lente pour les cellules cancéreuses et les cellules souches.
2. Réduire l'exposition à des températures élevées et à une durée de décongélation prolongée afin de minimiser le risque de dommages cellulaires.
3. Pendant la décongélation et la réactivation, manipulez les cellules avec précaution pour éviter de les endommager.
4. Vérifiez que les cellules sont endommagées et viables et suivez leur croissance avant de les utiliser dans des expériences.

Respectez les protocoles et les lignes directrices recommandés pour la décongélation et la réactivation des cellules cryoconservées.